[发明专利]高产普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法在审
| 申请号： | 201710410090.5 | 申请日： | 2017-06-03 |
| 公开（公告）号： | CN107058367A | 公开（公告）日： | 2017-08-18 |
| 发明（设计）人： | 纪明华;俞峰;刘校函;王辉;李统锋;丁少明 | 申请（专利权）人： | 白银赛诺生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/75 | 分类号： | C12N15/75;C12N15/56;C12R1/125 |
| 代理公司： | 兰州振华专利代理有限责任公司62102 | 代理人： | 张真 |
| 地址： | 730913*** | 国省代码： | 甘肃;62 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种高产普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法。将耐酸热普鲁兰酶基因经密码子优化后，分别和两种不同的分泌肽及启动子进行人工拼接，组成人工操纵子，并整合到枯草芽孢杆菌A164，整合位点分别为碱性蛋白酶（aprE）及淀粉酶基因（amyE）所在处；此外，还通过Cre重组酶的质粒表达，将整合到A164上的抗性基因进行了敲除；所获得的普鲁兰酶重组生产菌株CNP2的普鲁兰酶发酵酶活超过1000 U/mL。 | ||
| 搜索关键词： | 高产 普鲁兰酶 重组 枯草 芽孢 杆菌 构建 方法 | ||
【主权项】：
一种高产普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于：将人工合成的普鲁兰酶基因表达框Tpu1及Tpu2分别原位替代枯草芽孢杆菌的碱性蛋白酶基因aprE以及淀粉酶基因amyE，并将抗性基因ermC和kan敲除后得到所述重组枯草芽孢杆菌，具体步骤如下：a.设计并基因合成线性DNA片段Tpu1及Tpu2；b.以枯草芽孢杆菌A164为出发菌株进行分子构建，将Tpu1与枯草芽孢杆菌A164感受态细胞混合，进行转化，获得具有红霉素抗性的重组菌株CNP1；c.将Tpu2与枯草芽孢杆菌CNP1感受态细胞混合，进行转化，获得具有红霉素/卡那霉素双抗性的重组菌株CNP2ek；d.转入Cre表达质粒，进行红霉素/卡那霉素双抗性的消除，得到重组枯草芽孢杆菌CNP2，即重组枯草芽孢杆菌。
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