[发明专利]高产普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于制糖工业用酶安全生产菌株的构建技术领域，涉及一种高产普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌的构建方法。

背景技术

普鲁兰酶是食品行业制糖生产技术中不可或缺的一类酶，主要由原核微生物分泌表达的糖链解枝酶。生产应用中多使用这类酶中的I型普鲁兰酶，其能够专一性切开淀粉原料中由α-1,6糖苷键构成的支链分支，因此普鲁兰酶与其它淀粉水解酶共同作用，可以让淀粉得以完全酶解，得到单分子葡萄糖分子，其在淀粉加工等食品行业中有着广阔的市场前景。近年来，国内外对普鲁兰酶生产菌株的研发投入大量人力物力，许多工业酶生产企业先后开发出多种不同类型的重组生产菌株或诱变菌。在适合工业生产应用的多种普鲁兰酶蛋白中，来自长野芽胞杆菌 (Bacillus naganoensis) 的普鲁兰酶（Bn PulB），其酶学特征，包括最适反应温度及pH等均非常适合淀粉工业加工的需求，但该酶的原产菌的表达水平不高，因此其基因常被用于构建于重组表达生产，在适合食品工业用酶的宿主细胞中。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)因为其不表达致热源和毒素因子，且其分泌途径强大，因此被列为安全生产菌株（GRAS）之一，常被用于许多胞外酶发酵生产的首选宿主细胞。枯草芽孢杆菌有许多种，其各自的转化性能、分泌能力等相关很大，其中A164以其营养需求不高，发酵密度高，蛋白分泌水平高等原因被视为蛋白生产的理想宿主细胞。

为了提高生产菌株的遗传稳定性，外源表达通常被整合到宿主细胞的基因组中，而抗生素基因常用作筛选标记来使用，但是在食品工业中，携带抗生素基因的重组菌株会带来生物安全性的问题，因此，有必要在完成外源基因的整合后再通过二次重组或者特异性重组的方式，将抗生素基因去除，得到无抗的生产菌株。

发明内容

本发明的目的是提供一种高产普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌CNP2的构建方法—通过两次基因操作，将两份拷贝普鲁兰酶基因整合到枯草芽孢杆菌的基因组中，并通过特异性重组系统，将抗生素基因去除，从而获得了一株安全的普鲁兰酶高产菌株。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案具体如下：

将人工合成的普鲁兰酶基因表达框Tpu1及Tpu2分别原位替代枯草芽孢杆菌的碱性蛋白酶基因aprE以及淀粉酶基因amyE，并将抗性基因ermC和kan敲除后得到所述重组枯草芽孢杆菌，具体步骤如下：

a.设计并基因合成线性DNA片段Tpu1及Tpu2；

b.以枯草芽孢杆菌A164为出发菌株进行分子构建，将Tpu1与枯草芽孢杆菌A164感受态细胞混合，进行转化，获得具有红霉素抗性的重组菌株CNP1；

所述枯草芽孢杆菌A164，最开始分离自德国马尔堡，该菌种可以通过美国国家菌种保藏中心购买得到，菌种保藏号为ATCC 6051a；

c.将Tpu2与枯草芽孢杆菌CNP1感受态细胞混合，进行转化，获得具有红霉素/卡那霉素双抗性的重组菌株CNP2ek；

d.转入Cre表达质粒，进行红霉素/卡那霉素双抗性的消除，得到重组枯草芽孢杆菌CNP2，即重组枯草芽孢杆菌。

所述基因表达框Tpu1及Tpu2分别经密码子优化、基因合成后获得， Tpu1的核苷酸序列为：

caaatgcgct gaatgcctat gttacaggaa ttggggccaa taaacggatt gtattgtggg60

atacgacgct gaacaaactt gacgattcag aaattctgtt tattatgggc cacgaaatgg120

gccattatgt catgaagcac gtttacatcg gtctggctgg ctatttgctc gtgtcgctcg180

ccggatttta tgtcattgat aagctttaca agcggacggt tcgcctaacc cgcagcatgt240

ttcatttaga agggcggcat gatcttgcgg cacttccgct gttattgctt ttgttttctg300

ttttgagctt tgcggttacg cctttttcta atgctgtctc gcgttatcag gagaataagg360

ctgaccagta tgggatcgag ttgacagaga acagagaagc cgctgttaaa acgtttcagg420