[发明专利]一种用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒及其检测方法

摘要

本发明属于医学检验技术领域，具体涉及一种用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒及其检测方法。本发明提供的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒包括雌激素受体标准品，雌激素受体质控品，浓缩洗涤液，发光底物溶液Ⅰ，发光底物溶液Ⅱ，抗试剂和磁珠免疫复合物。本发明提供的用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒具有检测时间短、用量少、灵敏度高、特异性强、高重复性等优点。

主权项

1.一种用于检测雌激素受体的快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括雌激素受体标准品，雌激素受体质控品，浓缩洗涤液，发光底物溶液Ⅰ，发光底物溶液Ⅱ，抗试剂和磁珠免疫复合物；所述磁珠免疫复合物的制备包括以下步骤：取100μL浓度为10mg/mL的链霉亲和素磁珠，用250μL浓缩洗涤液按照1∶100稀释得到的溶液洗涤3～5次，加入40μL生物素化雌激素受体单克隆抗体，置于37℃恒温气浴摇床中振荡，振荡速度为120r/min，8～20min后取出，用200μL浓缩洗涤液按照1∶100稀释得到的溶液洗涤4次，然后，重新置于上述恒温气浴摇床中，加入1mL含体积分数为2％BSA的pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液进行封闭反应，封闭反应时间为10～25min，取出，磁性分离，去上清，用200μL浓缩洗涤液按照1∶100稀释得到的溶液洗涤4次，加入pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液配成1mg/mL的磁珠免疫复合物，置于4℃避光保存，即得；其中，所述浓缩洗涤液的制备方法为：向pH为7.4，浓度为1M的磷酸盐缓冲液中加入Tween‑20，使Tween‑20的体积分数为5％；所述生物素化雌激素受体单克隆抗体的制备包括以下步骤：1.1取雌激素受体单克隆抗体，用浓度为0.05mol/L，pH为9.5的碳酸盐缓冲溶液调整雌激素受体单克隆抗体的浓度为1mg/mL，得溶液Ⅰ；1.2 将生物素、二环己基碳二亚胺和N‑羟基琥珀酰亚胺溶于二甲基甲酰胺中，生物素、二环己基碳二亚胺和N‑羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1∶1∶1.2，于50℃水浴中磁力搅拌反应，反应时间为12h，滤去反应液中生成的白色沉淀二环己基脲，收集滤液，加入乙醚至沉淀不再增加，置于冰浴中，放置时间为1h，过滤收集沉淀，得活性生物素酯粗品，将上述活性生物素酯粗品用热异丙醇溶解，置于冰浴中，放置时间为3h，过滤收集结晶，用二甲基甲酰胺溶解后加入乙醚，置于冰浴中，放置时间为1h，过滤收集沉淀，真空干燥，得活性生物素酯；1.3向步骤1.1所得溶液Ⅰ中加入步骤B所得活性生物素酯，活性生物素酯与雌激素受体单克隆抗体的摩尔比为8～15∶1，室温反应，反应时间为20～40min，得反应液；1.4将步骤1.3所得反应液移至截留分子量为7000～10000的透析袋内，用浓度为0.05mol/L，pH为9.5的碳酸盐缓冲溶液透析24h，加入与上述反应液等体积的甘油，置‑25℃保存，即得；所述链霉亲和素磁珠的制备包括以下步骤：2.1 配制pH为7.0，浓度为0.1M的磷酸盐缓冲液，灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为15min，将1mg的链霉亲和素溶于1mL上述磷酸盐缓冲液中，得链霉亲和素溶液，取200μL上述链霉亲和素溶液装于EP管中；2.2 取2.5mL氨基化磁性微球，加入2mL戊二醛，室温震荡反应，反应时间为5h，进行磁分离，用水清洗除去多余的戊二醛后，将磁性微球重新悬浮在2.5mLpH为7.0，浓度为0.1M的磷酸盐缓冲液中，得磁性微球液；2.3 将步骤2.2所得磁性微球液加入到步骤2.1装有200μL链霉亲和素溶液的EP管中，室温震荡培养5h，磁分离，得固体物，将所得固体物分散在5mL pH为7.0，浓度为0.1M的磷酸盐缓冲液中，使浓度至10mg/mL，得链霉亲和素磁珠；所述步骤2.2中氨基化磁性微球的制备包括以下步骤：3.1 取0.05g四氧化三铁磁性纳米微球，加入2mL蒸馏水和10mL乙醇，磁力搅拌，加热升温至75℃，加入25μL甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵，反应5h后，降温至60℃，加入30μL氨水，30min后加入20μL正硅酸乙酯，反应2h后，降至室温，用乙醇和水进行洗涤，磁分离，得表面包覆二氧化硅的四氧化三铁磁性微球；3.2 向步骤3.1所得表面包覆二氧化硅的四氧化三铁磁性微球中，加入10mL乙醇和2mL水，超声，超声时间为1min，磁力搅拌，搅拌30分钟后，加入100μL氨水，继续搅拌，搅拌15分钟后，加入50μL氨丙基三甲氧基硅烷，反应5h后，用乙醇与水洗涤，磁分离，直至PH试纸检测到上清液为中性，得固体物，向所得固体物中加入pH为7.0，浓度为0.1M的磷酸盐缓冲液，使浓度至20mg/mL，得氨基化磁性微球；所述抗试剂的制备包括以下步骤：4.1 取雌激素受体单克隆抗体，用浓度为0.05mol/L，pH为9.5的碳酸盐缓冲溶液调整雌激素受体单克隆抗体的浓度为1mg/mL，得溶液A；4.2 取吖啶酯，加入二甲基甲酰胺使吖啶酯的浓度至2mg/mL，得溶液B；4.3 将步骤4.2所得溶液B加入到步骤4.1所得溶液A中，吖啶酯与雌激素受体单克隆抗体的摩尔比为15～25∶1，室温反应，反应时间为20～40min，得反应液；4.4将步骤4.3所得反应液移至截留分子量为7000～10000的透析袋内，用浓度为0.05mol/L，pH为9.5的碳酸盐缓冲溶液透析24h，加入与上述反应液等体积的甘油，置‑25℃保存，即得。