[发明专利]一种提高胰岛素及其类似物前体表达的毕赤酵母发酵方法

摘要

本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种提高胰岛素及其类似物前体表达的毕赤酵母发酵方法。发酵培养分为起始生长阶段、甘油补加阶段和甲醇诱导阶段。该方法通过控制起始培养基配方、氮源类型和碳源补加方式以及在发酵中后期通过连续或半连续补加少量微生物或植物来源的有机氮源使得发酵周期延长。在保证目标产物质量的同时，其产量提高了30%以上。

主权项

一种提高胰岛素及其类似物前体表达的毕赤酵母发酵方法，所述胰岛素及其类似物前体为重组人胰岛素或甘精胰岛素或门冬胰岛素，其特征在于：所述发酵方法包括如下步骤：1）起始生长阶段：将毕赤酵母菌株接种于发酵起始培养基中，随着菌体浓度逐渐增加，起始培养基中的碳源逐渐被消耗，溶氧值也逐渐下降，通过搅拌控制溶氧值≥50%，至发酵起始培养基碳源被消耗尽后，溶氧值开始反弹，反弹至80%时该阶段结束，所述发酵起始培养基组成为：甘油 20‑40 g/l，尿素5‑8 g/l，CaSO₄·2H₂O 0.4‑1.0 g/l，MgSO₄ 5‑8 g/l，KOH 20‑30 g/l，H₃PO₄ 20‑30 ml/l，PTM1溶液 2‑6 ml/l，消泡剂 1‑3 ml/l；所述PTM1溶液为CuSO₄·5H₂O 6 g/l，KI 0.08 g/l，MnSO₄·H₂O 3 g/l，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2 g/l，H₃BO₃ 0.02 g/l，ZnSO₄·7H₂O 20 g/l，FeSO₄·7H₂O 65 g/l，CoCl₂·6H₂O 0.5 g/l，H₂SO₄ 5 ml/l，Biotin 0.2 g/l；2）甘油补加阶段：所述步骤1）溶氧值反弹至80%时开始补加甘油溶液，设定甘油起始补加速率F₀=8‑12 g/l/h，然后基于毕赤酵母生长动力学模型实时调整甘油补加速率，控制溶氧值≥30%，使菌体活细胞呈指数生长；当实时活细胞浓度X=17‑19 pF/cm时，停止补加甘油；3）甲醇诱导阶段：停止补加甘油30‑50 min后，开始补加甲醇溶液进行诱导，设定起始甲醇补加速率F₀=3‑7 g/l/h，然后基于毕赤酵母生长动力学模型实时调整甲醇补加速率，控制溶氧值≤10%，使得毕赤酵母发酵产生的目标蛋白的增加量维持在每小时增加0.04‑0.045 g/l的速度；4）发酵培养至80‑100h时，以与甲醇相同补加速率连续补加有机氮源，有机氮源为50%（w/v）的酵母提取物或大豆蛋白胨，发酵培养130‑180 h结束；所述步骤1）起始生长阶段接种浓度为2.0‑6.0×10⁵ cfu/ml，温度控制在28‑32℃，空气通入比为1.0‑1.5 vvm；所述步骤2）甘油补加阶段控制温度为28‑32℃，空气通入比为1.0‑1.5 vvm， pH 4.0‑6.0；所述步骤3）甲醇诱导阶段控制温度为25‑28℃，空气通入比为1.5‑2.5 vvm，pH 4.0‑6.0；所述菌体生长动力学模型为F_t+△t =(1+μ_t)F_t，其中：F_t表示t时的碳源补加速率，μ_t表示t时的比生长速率，F_t+△t表示t+△t时的碳源补加速率。