[发明专利]一种提高胰岛素及其类似物前体表达的毕赤酵母发酵方法

说明书

本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种提高胰岛素及其类似物前体表达的毕赤酵母发酵方法。发酵培养分为起始生长阶段、甘油补加阶段和甲醇诱导阶段。该方法通过控制起始培养基配方、氮源类型和碳源补加方式以及在发酵中后期通过连续或半连续补加少量微生物或植物来源的有机氮源使得发酵周期延长。在保证目标产物质量的同时，其产量提高了30%以上。

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体涉及为一种提高胰岛素及其类似物前体表达的毕赤酵母发酵方法。

背景技术

糖尿病是一种常见的内分泌代谢疾病。近年来，全世界糖尿病的患病率都在迅猛增长。2015年，全球成年糖尿病患者数量达4.15亿，其中，中国的糖尿病患者人数超过了1亿。糖尿病成为继心脑血管疾病、肿瘤之后的另一个严重危害人民健康的重要慢性非传染性疾病。糖尿病的急、慢性并发症，尤其是慢性病并发症累及多个器官，致残、致死率高，严重影响患者的身心健康，并给个人、家庭和社会带来沉重的负担。

胰岛素治疗一直被当作是治疗糖尿病并使血糖得到良好控制的重要手段。上世纪70年代，人们通过基因工程技术开发出了重组人胰岛素。到90年代，随着胰岛素技术的不断发展，人们又相继开发出了具有不同作用时间特点的新一代胰岛素类似物，例如赖脯胰岛素、门冬胰岛素、赖谷胰岛素、地特胰岛素、德谷胰岛素、甘精胰岛素等。

在外源蛋白的表达过程中，毕赤酵母的胞内和胞外均有一定量的蛋白酶的表达，因此大多数外源蛋白均面临着被降解的问题。尤其是发酵培养后期，由于营养成分的缺失及有毒副产物的累积，大量细胞活性降低或裂解，从而释放出更多的蛋白酶。蛋白酶的存在不仅影响到目标蛋白的质量，同时也降低目标蛋白的产率。因此，为保证目标产物的质量及产量，行业内通常会提前终止培养。

毕赤酵母发酵过程中通常使用氨水来控制pH，该方法的优势在于pH控制的较为稳定。然而，由于氨水具有强烈的腐蚀性和刺激性且易爆，在使用和储存过程中存在较大的风险。另外，由于氨水不能灭菌，只能通过过滤器进行除菌，增加了过滤器及其验证的成本。

毕赤酵母发酵过程上的菌体浓度测定通常采用湿重法(WCW)或吸光度法(OD₆₀₀)，这两种测量方法均有较大误差，且培养基中的颗粒和死细胞均能被检测到，因此所测得的值不能反映真正活细胞的量。同时，这两种方法操作较为麻烦且涉及到取样操作，增加了染菌风险。另外，使用该方法通常几个小时测量一次，不能反映菌体的实时状态，很多关键阶段和异常情况可能会被漏掉。

毕赤酵母发酵过程中的碳源(甘油、甲醇等)的补加方式通常采用恒速补加、递增减或者恒定比生长速率，这几种方法均不能根据毕赤酵母的实时生长特性来进行碳源的补加。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高胰岛素及其类似物前体表达的毕赤酵母发酵方法。

本发明技术方案为：

一种提高胰岛素及其类似物前体表达的毕赤酵母发酵方法，所述发酵方法包括如下步骤：

1)起始生长阶段：将毕赤酵母菌株接种于发酵起始培养基中，接种浓度为2.0-6.0×10⁵cfu/ml，温度控制在28-32℃，空气通入比为1.0-1.5vvm，随着菌体浓度逐渐增加，起始培养基中的碳源逐渐被消耗，溶氧值也逐渐下降，通过搅拌控制溶氧值≥50％；至发酵起始培养基碳源被消耗尽后，溶氧值开始反弹，反弹至80％时该阶段结束；

2)甘油补加阶段：所述步骤1)溶氧值反弹至80％时开始补加甘油溶液，设定甘油起始补加速率F₀＝8-12g/l(毕赤酵母菌液)/h，然后基于微生物生长动力学模型实时调整甘油补加速率，使菌体活细胞呈指数生长，从而获得大量的有较高活性的菌体，控制温度为28-32℃，空气通入比为1.0-1.5vvm，溶氧值≥30％，pH 4.0-6.0；当实时活细胞浓度(即活细胞电容率)X＝17-19pF/cm时，停止补加甘油；