[发明专利]一种丝状真菌固体发酵产物总蛋白的提取方法

摘要

本发明公开了一种丝状真菌固体发酵产物总蛋白的提取方法。本方法的技术核心是结合玻璃珠机械破壁与细胞破碎缓冲液(SI)的方法，来破坏丝状真菌厚实坚韧的细胞壁并释放出胞内总蛋白，并在提取缓冲液(SII)和蛋白酶抑制剂的保护下提取到高质量的木霉固体发酵产物总蛋白。本发明采用了一种简单易行的方法，克服了丝状真菌细胞壁厚实坚韧、胞内蛋白难以释放，固体发酵物中高有机质和腐殖酸类物质的干扰，结合半透膜透析法可以直接从木霉固体发酵产物中提取到高质量的总蛋白，为固体发酵过程中丝状真菌蛋白质组学的研究提供技术保障。

主权项

1.一种丝状真菌固体发酵产物总蛋白的提取方法，其特征在于包括以下步骤：（1）将丝状真菌固体发酵产物置于氧化锆内壁的球磨仪罐体中，加入提前预冷的裂解液SI和氧化锆球，涡旋均匀；加入DDT溶液后涡旋，然后进行冰浴，冰浴结束后于冷冻混合球磨仪上进行研磨；所述的SI溶液的配制方法为：8 M尿素、2 M硫脲、1 mM EDTA、10 mM PBS，0.1%Triton-X-100，充分溶解后4℃冰箱保存，使用前加入罗氏蛋白酶抑制剂cocktail；上述百分比浓度均为质量体积比浓度（w/v）; 所述的DDT溶液配制方法为：1.55gDTT用去离子水定容至10 mL，-20℃保存备用；冷冻混合球磨仪工作程序设置为研磨净时间为10min，每2分钟暂停1分钟，研磨温度设置为4℃;（2）研磨结束后加入提取液SII，将固体发酵产物与氧化锆珠混合均匀后冰浴；冰浴结束后转移到球磨仪上进行研磨；所述的SII溶液配方为：3% CHAPS、1% SDS、0.1% 脱氧胆酸钠，0.2 mg/mL BSA;（3）将步骤（2）中研磨好的混合物转移到离心管中，4℃下离心；离心结束后，将上清转移到新的离心管中，并丢弃沉淀；（4）将上清液进行冰浴后，按照1:4的体积比加入100% TCA溶液混合均匀，将混合液保存在-20℃条件下2小时，然后将其置于冰上直至液化；（5）待上清液完全液化后，在4℃离心，弃上清，将离心管倒置在吸水纸上，除去多余的液体；往沉淀中加入提前预冷的丙酮，并用移液枪来回吸打将沉淀重悬浮于丙酮当中，将沉淀吹打混匀后， 4℃离心，移除上层的液体；重复丙酮重悬-离心-弃上清的步骤2-5次，直到丙酮颜色不那么深后，移除上层丙酮，将多余的丙酮挥发干净，固体粉末即为丝状真菌固体发酵产物中的总蛋白，将固体粉末保存于-20℃。