[发明专利]一种丝状真菌固体发酵产物总蛋白的提取方法

权利要求书

1.一种丝状真菌固体发酵产物总蛋白的提取方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将丝状真菌固体发酵产物置于氧化锆内壁的球磨仪罐体中，加入提前预冷的裂解液SI和氧化锆球，涡旋均匀；加入DDT溶液后涡旋，然后进行冰浴，冰浴结束后于冷冻混合球磨仪上进行研磨；所述的SI溶液的配制方法为：8 M尿素、2 M硫脲、1 mM EDTA、10 mM PBS，0.1%Triton-X-100，充分溶解后4℃冰箱保存，使用前加入罗氏蛋白酶抑制剂cocktail；上述百分比浓度均为质量体积比浓度（w/v）; 所述的DDT溶液配制方法为：1.55gDTT用去离子水定容至10 mL，-20℃保存备用；冷冻混合球磨仪工作程序设置为研磨净时间为10min，每2分钟暂停1分钟，研磨温度设置为4℃;

（2）研磨结束后加入提取液SII，将固体发酵产物与氧化锆珠混合均匀后冰浴；冰浴结束后转移到球磨仪上进行研磨；所述的SII溶液配方为：3% CHAPS、1% SDS、0.1% 脱氧胆酸钠，0.2 mg/mL BSA;

（3）将步骤（2）中研磨好的混合物转移到离心管中，4℃下离心；离心结束后，将上清转移到新的离心管中，并丢弃沉淀；

（4）将上清液进行冰浴后，按照1:4的体积比加入100% TCA溶液混合均匀，将混合液保存在-20℃条件下2小时，然后将其置于冰上直至液化；

（5）待上清液完全液化后，在4℃离心，弃上清，将离心管倒置在吸水纸上，除去多余的液体；往沉淀中加入提前预冷的丙酮，并用移液枪来回吸打将沉淀重悬浮于丙酮当中，将沉淀吹打混匀后， 4℃离心，移除上层的液体；重复丙酮重悬-离心-弃上清的步骤2-5次，直到丙酮颜色不那么深后，移除上层丙酮，将多余的丙酮挥发干净，固体粉末即为丝状真菌固体发酵产物中的总蛋白，将固体粉末保存于-20℃。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述的丝状真菌为木霉。

3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于所述的丝状真菌为贵州木霉。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的提取方法，其特征在于所述的丝状真菌固体发酵产物是将丝状真菌接种于农业废弃物秸秆中进行固体发酵，待固体发酵基质中长满菌丝后停止培养，得所述的丝状真菌固体发酵产物；所述的农业废弃物秸秆选自水稻秸秆、小麦秸秆或玉米秸秆中的任意一种。

5.根据权利要求4所述的提取方法，其特征在于包括如下步骤：

（1） 称取培养好的丝状真菌固体发酵产物于清洗干净的球磨仪氧化锆内壁罐子，并加入提前预冷的裂解液SI中和0.5mm的氧化锆珠子；将罐体置于涡旋仪上，以1800-2200 rpm/min将固体发酵产物与氧化锆珠混合均匀；打开罐体后入DDT溶液并涡旋2分钟，将罐体冰浴15min；冰浴结束后将罐体装在冷冻混合球磨仪上进行研磨；其中丝状真菌固体发酵产物与裂解液SI的质量体积比为1g：3-7mL；丝状真菌固体发酵产物与氧化锆珠子的质量比为1:（0.8-1.2）；丝状真菌固体发酵产物与DDT溶液的质量体积比为1g：3-7μL；

（2）研磨结束后将罐体置于冰上15 min，打开罐体并加入提取液SII，将罐体置于涡旋仪上，以中速将固体发酵产物与氧化锆珠混合均匀，将罐体冰浴30分钟；冰浴结束后将罐体转移到球磨仪上进行研磨，研磨温度设置为4℃，研磨净时间为10min，每2分钟暂停1分钟；丝状真菌固体发酵产物与提取液SII的质量体积比为1.8-2.2g：1mL；

（3）将研磨好的混合物转移到清洗干净的离心管中，4℃ 8000 rpm 条件下离心10min；离心结束后，将上清转移到新的离心管中，并丢弃沉淀，总蛋白存在于上清液中；

（4）将上清液进行冰浴10分钟后，按照1:4的体积比加入100% TCA溶液并离心管上下颠倒使其充分混合均匀；将混合液保存在-20℃条件下2-4小时；冷冻时间到了以后，并将其置于冰上直至液化；

（5）待上清液完全液化后，在4℃ 8000 rpm 条件下离心10 min；离心结束后弃上清，将离心管倒置在吸水纸上，除去多余的液体；往沉淀中加入提前预冷的丙酮，并用移液枪来回吸打将沉淀重悬浮于丙酮当中，将沉淀吹打混匀后，在4℃ 8000 rpm 条件下离心10 min，移除上层的液体；重复上述步骤3次，直到丙酮颜色不那么深后，移除上层丙酮，利用氮吹仪将多余的丙酮挥发干净，固体粉末即为固体发酵产物中的总蛋白，将固体粉末保存于-20℃。