[发明专利]一种微小隐孢子虫的夹心ELISA检测方法及其应用

摘要

本发明公开了一种微小隐孢子虫的夹心ELISA检测方法，具体步骤如下（1）制备检测性抗原和免疫性抗原；（2）用免疫性抗原免疫健康成年家兔，制备兔抗微小隐孢子虫血清抗体IgG；（3）用免疫性抗原免疫健康产蛋鸡，制备抗微小隐孢子虫卵黄抗体IgY；（4）以IgG为捕获抗体，IgY为检测抗体的夹心ELISA检测步骤包括IgG包被、封闭、加抗原、加IgY、加酶标抗体、加底物显色和终止反应。本发明相对于巢式PCR方法，只需要封闭液、底物溶液、PBS溶液等，这些试剂价格较低，试验时只需用到酶标仪，有着耗材少，成本低，操作简便，试验时间短，更适用于大量临床样品的检测等优点。

主权项

一种微小隐孢子虫的夹心ELISA检测方法，其特征在于：具体步骤如下：(1)将微小隐孢子虫卵囊反复冻融和超声波裂解后，离心，上清液作为检测性抗原，沉淀作为免疫性抗原；(2)用免疫性抗原免疫健康成年家兔，制备兔抗微小隐孢子虫血清抗体IgG，并用盐析法纯化IgG；(3)用免疫性抗原免疫健康产蛋鸡，制备抗微小隐孢子虫卵黄抗体IgY，并用水稀释硫酸铵盐析法纯化IgY；(4)以IgG为捕获抗体，IgY为检测抗体的夹心ELISA检测步骤：a.IgG包被：用包被液将纯化后的IgG稀释后包被96孔酶标板，100μL/孔，37℃下包被1h后，4℃下过夜，弃去包被液，用洗涤液洗涤3次，拍干；b.封闭：每孔加200μL封闭液，37℃下封闭1h后，弃去封闭液，用洗涤液洗涤3次，拍干；c.加抗原：将步骤(1)制备的检测性抗原用0.01M PBS稀释，100μL/孔，37℃下反应lh后，甩弃液体，用洗涤液洗涤3次，拍干；d.加IgY：将IgY用0.01M PBS稀释，100μL/孔，37℃下孵育30min后，甩弃液体，用洗涤液洗涤3次，拍干；e.加酶标抗体：加用0.01M PBS稀释好的HRP标记的羊抗鸡的酶标抗体，100μL/孔，37℃下作用45min后，甩弃液体，洗涤液洗板3次，拍干；f.加底物显色：加TMB显色液，100μL/孔，室温避光作用10min；g.终止反应：加入终止液，50μL/孔，用酶标仪测OD450值，计算出P/N值，P/N＝(待检样品孔OD450值‑空白孔OD450值)/(阴性样品孔OD450值‑空白孔OD450值)，若P/N≥2.1，判为阳性，若P/N<2.1，判为阴性。