[发明专利]一种微小隐孢子虫的夹心ELISA检测方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于微小隐孢子虫的检测技术领域，具体涉及一种微小隐孢子虫的夹心ELISA检测方法及其应用。

背景技术

隐孢子虫（Cryptosporidium）是一种重要的人兽共患肠道原虫，其宿主范围十分广泛，可感染包括人类在内的哺乳动物、鸟类、爬行类、两栖类和鱼类等多种脊椎动物，主要寄生于宿主胃肠道上皮细胞内。隐孢子虫多通过受污染的水源和食物等途径传播，由其感染可导致以腹泻为主要临床症状的人兽共患寄生虫病。目前，31个物种被认为是有效的，其中，微小隐孢子虫（C.parvum）是最常见的人兽共患虫种之一，主要引起未断奶犊牛严重腹泻甚至死亡，并可导致包括人在内的多种脊椎动物腹泻。免疫功能健全的宿主感染隐孢子虫后一般表现为自限性的短期急性腹泻；而免疫力低下、免疫功能缺陷或抑制者则通常表现为持久的水样腹泻，导致体液大量丢失而危及生命。在艾滋病病人和儿童中感染率分别高达48%和17.5%，是艾滋病病人的重要致死因素。该病已被确认为引起人腹泻的六大病因之一，并被世界卫生组织（WHO）和美国疾病防控中心（CDC）列入新发传染病。

隐孢子虫病作为一种重要的人兽共患性原虫病，很常见但很难治疗，目前尚无有效的治疗方法，并且其检出率也比较低。关于免疫学检测法主要有免疫荧光技术、酶免疫分析法、免疫印迹法、免疫磁珠分离法、流式细胞仪技术和间接血凝试验等，因特异性高、敏感性强，便于批量检测等优点，被广泛应用于隐孢子虫病诊断中，但是这些方法对于隐孢子虫的检出率比较低，因此建立简便、特异、敏感的免疫学诊断技术，对于人和动物隐孢子虫病的防控具有重要意义。

发明内容

针对当前粪便检测隐孢子虫灵敏度低、费时费力的缺点，本发明提供一种微小隐孢子虫的夹心ELISA检测方法及其应用。

本发明的目的是以下述方式实现的：

一种微小隐孢子虫的夹心ELISA检测方法，具体步骤如下：

（1）将微小隐孢子虫卵囊反复冻融和超声波裂解后，离心，上清液作为检测性抗原，沉淀作为免疫性抗原；

（2）用免疫性抗原免疫健康成年家兔，制备兔抗微小隐孢子虫血清抗体IgG，并用盐析法纯化IgG；

（3）用免疫性抗原免疫健康产蛋鸡，制备抗微小隐孢子虫卵黄抗体IgY，并用水稀释硫酸铵盐析法纯化IgY；

（4）以IgG为捕获抗体，IgY为检测抗体的夹心ELISA检测步骤：

a. IgG包被：用包被液将纯化后的IgG稀释后包被96孔酶标板，100μL/孔，37℃下包被1 h后，4℃下过夜，弃去包被液，用洗涤液洗涤3次，拍干；

b. 封闭：每孔加200μL封闭液，37℃下封闭1h后，弃去封闭液，用洗涤液洗涤3次，拍干；

c. 加抗原：将步骤（1）制备的检测性抗原用0.01M PBS稀释，100μL/孔，37℃下反应lh后，甩弃液体，用洗涤液洗涤3次，拍干；

d. 加IgY：将IgY用0.01M PBS稀释，100μL/孔，37℃下孵育30min后，甩弃液体，用洗涤液洗涤3次，拍干；

e. 加酶标抗体：加用0.01M PBS稀释好的HRP标记的羊抗鸡的酶标抗体，100 μL/孔，37℃下作用45min后，甩弃液体，洗涤液洗板3次，拍干；

f. 加底物显色：加TMB显色液，100μL/孔，室温避光作用10 min；

g. 终止反应：加入终止液，50μL/孔，用酶标仪测OD₄₅₀值，计算出P/N值，P/N=（待检样品孔OD₄₅₀值-空白孔OD₄₅₀值）/（阴性样品孔OD₄₅₀值-空白孔OD₄₅₀值），若P/N≥2.1，判为阳性，若P/N< 2.1，判为阴性。

步骤（1）中所述微小隐孢子虫卵囊为用微小隐孢子虫感染犊牛进行传代，大量收集粪便并纯化后获得的卵囊。

所述步骤（4）中的c步骤中，检测性抗原稀释后的浓度为2.5μg/mL。

所述步骤（4）中的a步骤中，用包被液将纯化后的IgG稀释800倍。

所述步骤（4）中的d步骤中，将IgY稀释100倍。

所述步骤（4）中的e步骤中，HRP标记的羊抗鸡的酶标抗体稀释5000倍。

所述步骤（4）中，包被液由无水碳酸钠1.59g，碳酸氢钠2.93g，加蒸馏水定容至1000mL而得；