[发明专利]复杂基质中贝类毒素的筛查与确证方法

摘要

本发明公开了一种复杂基质中贝类毒素的筛查与确证方法，包括下列步骤：（1）基质样品的制备、（2）基质样品的纯化与毒素分离、（3）质谱库的建立、（4）样品信息采集与结果的判定、（5）疑似阳性样品以及代谢产物进行高分辨质谱测定、（6）确定精确分子质量定性。本发明构建了24种贝类毒素的质谱数据库，可用于样品筛查过程中的高精准定性分析，实现了无毒素标品的盲查与准确定性。解决了标准品昂贵，到货周期长以及受出入境管控等影响因素，大大降低日常监控过程中的检测成本，同时，降低贝类检测对操作人员的技术水平要求，使其更易于操作。

主权项

1.一种复杂基质中贝类毒素的筛查与确证方法，其特征在于，包括下列步骤：(1)基质样品的制备分别配置浓度为10μg/kg～50μg/kg的11种脂溶性贝类毒素混合标准溶液，包括腹泻性贝类毒素OA、DTX1和DTX2，蛤毒素PTX2，虾夷扇贝毒素YTX、OH‑HomoYTX，环亚胺类毒素SPX1和GYM，原多甲藻酸毒素AZA1、AZA2和AZA3；以及13种麻痹性贝类毒素混合标准溶液，麻痹性贝类毒素是STX、NEO、dcSTX、GTX2、GTX3、GTX1、GTX4、GTX5、C1、C2、dcGTX2、dcGTX3、dcNEO，使用注射器，分别注射入活体扇贝、贻贝、牡蛎以及蛤四种样品基质的内脏组织中，使注射后的生物体内各种毒素的含量为1～5ug/kg，样品量为10g；将上述生物样本，置于0.45μm过滤后海水中暂养，充氧气，至注射后12～48h，取全组织样本，沥干水分，匀浆后，‑18℃冷冻，制得基质样品；(2)基质样品的纯化与毒素分离脂溶性贝类毒素：将样品置于50mL离心管中，加入10～50mL甲醇，涡旋混合1min，超声提取5min；4000r/min离心5min，取上清液置于梨形瓶中，残渣中加入10～50mL甲醇，重复提取一次，合并两次提取液；50℃旋转蒸发至干，加入5ml的25％～50％甲醇水溶液，充分超声溶解后，待净化；依次用1mL甲醇、1～3mL 30％～50％甲醇水溶液活化StrataTM‑X固相萃取柱，注入提取液，再用1～5mL 20～30％甲醇水溶液淋洗，最后用1mL甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，甲醇定容至1mL；洗脱液过0.22μm滤膜后，得基质标准品用于谱库建立；麻痹性贝类毒素：将样品置于50mL离心管中，加入20～50mL 1％～10％乙酸水溶液，涡旋混合90s；将离心管密封置于沸水中煮沸5min，取出置于流水下冷却至室温；4500r/min离心10min，待净化；移取上述提取液1mL于2mL离心管中，加入5μL氨水，涡旋混匀；依次用2mL乙腈，2～4mL含1％乙酸的20％～50％乙腈水溶液、2～6mL 0.1％～0.5％氨水溶液活化Supelco ENVI‑Carb固相萃取柱，加入500μL提取液，再用700μL超纯水淋洗，正压挤干，最后用1mL含0.25％甲酸的75％～80％乙腈水洗脱混匀，过0.22μm滤膜于进样小瓶中，得基质标准品用于谱库建立；(3)质谱库的建立：以上述基质标准品为样品，应用LC‑MS‑Qtrap质谱采集条件；调节液相条件为乙腈与水的流速分别为0.15mL/min，采用等度洗脱方法；通过自动进样器采样，不接色谱柱，改用两通，采集时间2min；分别选取有代表性，具有丰富的离子碎片信息的质谱图，分别建立并储存碰撞能为20，35，50和35±15eV时的全扫描质谱图至质谱谱库；同时描述贝类毒素的名称，CAS号、精确分子质量、结构式、采集条件、常规保留时间信息；(4)样品信息采集与结果的判定对样品进行提取，通过固相萃取柱净化后，通过LC‑MS‑Qtrap的MRM质谱采集条件进样，检测24种目标贝类毒素；在实际样品检测过程中，调节Q2中的碰撞能量获得丰富的碎片，将所获得的EPI谱图与谱库中该化合物的谱图匹配，当Fit 超过85时，为确证分析的有效判据；当Fit值小于50可判为阴性；通过LC‑MS‑Qtrap的MIM质谱采集条件进样，检测贝类毒素目标代谢产物与未知贝类毒素；在实际样品检测过程中，调节Q2中的碰撞能量获得丰富的碎片，然后对其主要碎片做MS3，归属碎片来源，确定化合物结构；(5)疑似阳性样品以及代谢产物进行高分辨质谱，确定精确分子质量对Fit>85％的疑似阳性样品和疑似贝类毒素代谢产物样品进行高分辨质谱检测，精确分子质量定性分析；通过液相色谱条件，结合四极杆‑静电场轨道阱高分辨质谱系统的Full MS/dd‑MS2监测模式，以Full MS一级质谱全扫描提取母离子精确质量数所得的色谱峰面积进行定量，以保留时间和dd‑MS2数据依赖子离子扫描所得的二级子离子质谱图进行定性确证；24种贝类毒素的精确质量数偏差不大于3×106；将目标代谢产物与未知贝类毒素代谢产物的二级子离子进行碎片归属，通过特征子离子的相对丰度值进行定性分析，从而确定代谢产物类型；24种贝类毒素名称，分子式以及理论与实际检测精确质量数范围见下表：。