[发明专利]一种山豆根中黄酮类化合物的提取检测方法

摘要

本发明提供了一种山豆根中黄酮类化合物的提取检测方法，待检测的黄酮类化合物为lupinifolin和山豆根色满二氢黄酮C，分别简称为黄酮1和黄酮4；本发明创造性地将基质固相分散萃取技术和反向微乳毛细管电动色谱技术结合，采用离线富集和在线富集技术的联用实现山豆根中黄酮类化合物的二次富集，有利于其定量检测，且本发明在一个微量体系中实施，所用药材以及实验药品试剂均在微克级别，有害化学试剂使用量少，安全，经济，环保。

主权项

1.一种山豆根中黄酮类化合物的提取检测方法，待检测的黄酮类化合物为lupinifolin和山豆根色满二氢黄酮C，分别简称为黄酮1和黄酮4，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：(a)制备黄酮类化合物提取液将山豆根药材粉末和吸附剂混合并研磨均匀，得到固体混合物；将所得固体混合物装填入固相萃取柱中，并用洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，离心取上层清液，得到黄酮类化合物提取液；所述山豆根药材粉末和吸附剂的质量比为1：0.5～3；所述的吸附剂为：C18、Al2O3、硅胶、硅藻土、弗罗里硅土、ZSM‑5、TS‑1、SAPO‑11、MCM‑48或SBA‑15；所述研磨的时间为90～210s；所述的洗脱剂为：甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、甲醇/乙腈体积比1：1的混合溶剂或甲醇/乙醇体积比1：1的混合溶剂；所述洗脱剂的体积用量为固相萃取柱体积的0.15～0.8倍；(b)检测样品溶液取步骤(a)中制备的黄酮类化合物提取液，挥干后先用甲醇溶解配制成50～100mg/mL浓度的溶液，再用0.25mM硼砂缓冲液稀释1～5倍，然后经0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液即为待测样品溶液；采用反向微乳毛细管电动色谱法对所得待测样品溶液进行检测，获得待测样品溶液的电泳谱图；所述微乳毛细管电动色谱法的分离条件为：色谱柱为56cm×50μm未涂层石英毛细管，运行电压‑15～‑30v；检测温度20～35℃；常规电压进样条件：‑20kv，5s；检测波长280nm；微乳液组成：表面活性剂0.8％～3.0％、辅助表面活性剂2.2％～10％、油相0.3％～0.9％、有机改性剂10％～20％、手性拆分剂10mM、余量为缓冲液pH＝1～3的10～30mM NaH2PO4水溶液；所述微乳液的组成中，所述的表面活性剂为十二烷基硫酸钠，所述的辅助表面活性剂为正丁醇，所述的油相为乙酸乙酯，所述的有机改性剂为乙腈，所述的手性拆分剂为甲基‑β‑环糊精或磺丁基‑β‑环糊精钠；所述反向微乳毛细管电动色谱法的富集条件为：样品基质pH＝7.5～9.5的0.1～10mmol/L硼砂缓冲液，水塞组成体积分数10％乙腈水溶液，进水时间5～40s，进样时间20～40s，进样电压‑10～‑25kv，运行电压‑20kv，检测温度25℃；(c)绘制标准曲线精密称取黄酮1和黄酮4标准品，配制一系列不同浓度的混合标准品溶液，采用反向微乳毛细管电动色谱法并按照步骤(b)中的分离条件和富集条件分别对各混合标准品溶液进行检测，得到混合标准品溶液的电泳谱图，分别以谱图中黄酮1和黄酮4的峰面积为纵坐标，以混合标准品溶液中黄酮1和黄酮4的质量浓度为横坐标作图，获得黄酮1和黄酮4的标准曲线和标准曲线方程；所述混合标准品溶液的配制方法为：精密称取质量比为1：1～3的黄酮1和黄酮4标准品，先用甲醇溶解制备黄酮1浓度在0.5～1200μg/mL范围内的溶液，再用0.25mM硼砂缓冲液稀释1.2～1200倍；(d)获取样品检测结果将步骤(b)所得待测样品溶液的电泳谱图中黄酮1和黄酮4的峰面积值代入步骤(c)所得标准曲线方程中，计算得出待测样品溶液中黄酮1和黄酮4的质量浓度，进而换算得到山豆根中黄酮1和黄酮4的含量。