[发明专利]一种基于iTRAQ标记测定烟碱诱导细胞差异表达蛋白质的方法

摘要

本发明为一种基于iTRAQ标记测定烟碱诱导细胞差异表达蛋白质的方法，提供一种烟碱暴露神经细胞差异蛋白质组的分析方法。具体而言，神经细胞经含有烟碱的培养基培养后，经蛋白质的抽提，蛋白浓度、样品质量及平行性的测定，酶解，iTRAQ标记和nano‑LC‑Q‑TOF分析鉴定后，进行搜库分析。本发明的方法定量分析了1mmol/L烟碱暴露1h SHSY‑5Y蛋白质的差异表达，其中参与MAPK级联生物过程和蛋白酶体信号通路的蛋白酶体蛋白，可能在烟碱成瘾中发挥重要作用，从而达到了解烟碱诱导神经细胞的差异表达蛋白质及差异蛋白质参与的生物过程的目的。

主权项

1.一种基于iTRAQ标记测定烟碱诱导细胞差异表达蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤：/n1) 样品前处理：将细胞分成实验组和对照组，分别在含或不含烟碱的细胞培养基中培养，然后提取细胞全蛋白；/n2) 蛋白质酶解：分别对步骤1)得到的实验组和对照组的细胞全蛋白依次进行还原和烷基化处理，然后在适合酶解的条件下加入胰蛋白酶，收集酶解得到的肽段；/n3) iTRAQ标记：采用不同分子量的iTRAQ试剂标记步骤2)得到的实验组的肽段和对照组的肽段，将经标记的两组肽段混合，除盐，冻干；/n4) nano-LC-Q-TOF测定：将步骤3)得到的肽段混合物上样到nano-LC-Q-TOF中，进行液相色谱-质谱分析；/n5) 差异蛋白筛选：将步骤4)得到的数据导入mascot软件对Uniprot-human数据库进行搜库，筛选差异表达蛋白质；/n其中所述步骤4)中，所述液相色谱包括以下条件：/nTrap柱为acclamin pepmap，分析柱为acclamin pepmap RPLC，柱温55℃；流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：0.1%甲酸乙腈溶液，流速0.4μl/min，进样量2μl，流动相梯度如下所示：/n流动相梯度/n