[发明专利]一种基于iTRAQ标记测定烟碱诱导细胞差异表达蛋白质的方法

说明书

本发明为一种基于iTRAQ标记测定烟碱诱导细胞差异表达蛋白质的方法，提供一种烟碱暴露神经细胞差异蛋白质组的分析方法。具体而言，神经细胞经含有烟碱的培养基培养后，经蛋白质的抽提，蛋白浓度、样品质量及平行性的测定，酶解，iTRAQ标记和nano‑LC‑Q‑TOF分析鉴定后，进行搜库分析。本发明的方法定量分析了1mmol/L烟碱暴露1h SHSY‑5Y蛋白质的差异表达，其中参与MAPK级联生物过程和蛋白酶体信号通路的蛋白酶体蛋白，可能在烟碱成瘾中发挥重要作用，从而达到了解烟碱诱导神经细胞的差异表达蛋白质及差异蛋白质参与的生物过程的目的。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，更具体而言，本发明涉及烟碱暴露神经细胞中差异表达蛋白质的测定方法。

背景技术

烟碱是奖励习惯性抽烟的主要成分，是导致吸烟成瘾的主要原因。吸烟时，烟碱随烟气经口腔到达肺部后，被肺泡中的毛细血管吸收，由肺部静脉循环经心脏进入体循环动脉系统，在吸烟后约10-20秒进入大脑，与烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)结合，使受体的离子通道打开，钙离子和钾离子等进入神经元，诱导一系列生物过程的改变而导致成瘾。

蛋白质是生命活动的体现者，研究表明反复接触成瘾药物包括烟碱、吗啡、大麻等可以引起大脑特定区域蛋白质表达水平的改变，这种表达的改变不仅参与单个神经元和相关神经回路的调节，还可能对成瘾相关的异常行为产生影响。因此，识别参与形成和维持药物依赖的蛋白是理解药物成瘾潜在分子机制的关键。

目前关于蛋白质表达的测定方法报道很多。蛋白质组学技术能够动态监测蛋白质的变化，是鉴定烟碱诱导蛋白质表达的主要方法。

相对和绝对定量同位素标记(iTRAQ)是由AB SCIEX公司研发的一种体外同种同位素标记的相对与绝对定量技术。该技术利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团，经高精度质谱仪串联分析，可同时比较多种样品的蛋白表达量，是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术。但是，尚未见到将该技术用于烟碱作用细胞的差异蛋白质组学研究的报道。

发明内容

针对上述技术问题，本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种通量高、重复性好的烟碱作用细胞的差异蛋白质组学研究方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现。

本发明提供一种基于iTRAQ标记测定烟碱诱导细胞差异表达蛋白质的方法，所述方法包括以下步骤：

1)样品前处理：将细胞分成实验组和对照组，分别在含或不含烟碱的细胞培养基中培养，然后提取细胞全蛋白；

2)蛋白质酶解：分别对步骤1)得到的实验组和对照组的细胞全蛋白依次进行还原和烷基化处理，然后在适合酶解的条件下加入胰蛋白酶，收集酶解得到的肽段；

3)iTRAQ标记：采用不同分子量的iTRAQ试剂标记步骤2)得到的实验组的肽段和对照组的肽段，将经标记的两组肽段混合，除盐，冻干；

4)nano-LC-Q-TOF测定：将步骤3)得到的肽段混合物上样到nano-LC-Q-TOF中，进行液相色谱-质谱分析；

5)差异蛋白筛选：将步骤4)得到的数据导入mascot软件对Uniprot-human数据库进行搜库，筛选差异表达蛋白质。

在本发明提供的方法中，在所述步骤1)中，所述细胞优选为神经细胞，更优选为神经母瘤细胞；

优选地，烟碱在细胞培养基中的浓度为1mol/L；

优选地，所述步骤1)包括以下步骤：