[发明专利]一种简便、高效且通用的植物叶绿体基因组测序方法

摘要

本发明公开了一种简便、高效且通用的植物叶绿体基因组测序方法，直接采用基因组DNA高通量测序后，利用生物学信息学方法抓取其中的叶绿体reads，然后组装、拼接获得其叶绿体基因组全序列；相比于传统的方法，该方法直接以叶片基因组DNA为模板构建高通量测序文库，大大提高了方法的效率和通用性；不用复杂的PCR产物测序及克隆片段的拼接组装，直接利用高覆盖度测序后得到的reads从头拼装，大大减少了试验步骤，简化了试验流程，简便、快捷且高效。

主权项

一种简便、高效且通用的植物叶绿体基因组测序方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、直接分离、纯化植物叶片的基因组DNA将植株在强光下曝光2天后，选择较深绿色的叶片100mg，利用常规微量DNA提取方法提取叶片的基因组DNA，保存于低温备用；S2、基因组DNA的高通量文库构建及测序取上述提取的基因组DNA 5ug，采用超声波进行物理随机打断或者dsDNA水解酶进行酶切，然后用MinElTte PCR回收试剂盒回收片段化的叶绿体DNA，再将片段化的DNA末端补齐，并加上测序接头，用MinElute PCR回收试剂盒回收加上接头的DNA，电泳并利用胶回收试剂盒回收200‑500bp的片段，PCR扩增回收片段构建测序文库；测序文库构建和测序反应采用IIITmina公司的标准程序，测序平台为IIIumina Hiseq4000，文库大小为300bp，测序策略为PE150；S3、测序数据的预处理测序后采用IIIumina HCS 1.1软件进行测序图像的转换及质量值计算，将图像信息转变为序列信息，然后去除载体序列、低质量序列获得可用于候选分析的测序数据；然后从NCBI下载其所收录的所有植物叶绿体基因组序列作为参考序列，将获得的测序数据利用botwie软件进行基因组映射，具体命令为bowtie2‑‑al‑conc alconc‑‑un‑conc unconc‑‑un unpaired‑‑al aligned‑x all_plant_chloroplast_sequence‑1 clean_data_P1‑2 clean_data_P2‑s out.sam，将能比对上参考基因组的左右两端序列分别放入到mapped_reads_p1和mapped_reads_p2文件中，用于候选的叶绿体基因组组装；S4、叶绿体基因组的组装和拼接对上述步骤得到mapped reads数据集，利用soapdenovo软件对得到的reads进行从头拼装得到序列contigs，然后利用Pair‑end关系对contigs进行连接，再用gapcloser进行补洞，得到scaffold序列，然后再用所有mapped reads映射所有scaffold，再一次填补空缺位置；同时，选择与目标物种近缘关系最近的已测序的叶绿体为参考，利用MAQ软件将mapped reads对参考基因组进行映射，得到一条一致序列；然后利用blat工具将拼接得到的scaffold序列按照参考基因组进行排序，空缺区域用consensus序列对应位置填补，得到叶绿体基因组的草图；最后，再用所有mapped reads映射草图，补可能的空缺位置，最终得到叶绿体基因组精细图；S5、叶绿体基因组的验证和评估首先，将组装获得的叶绿体基因组与多个近缘或者同一科的不同叶绿体基因组进行多序列比对，鉴定基因组的变异热点区域，判断可能出现拼接错误的位置；然后，根据拼接得到的叶绿体基因组，随机选择4‑5处序列设计引物，重点针对可能出现错误的位置，PCR扩增后sanger测序，然后利用ClustalW软件将测序结果与拼接的叶绿体基因组序列进行比对，根据比对结果验证拼接的准确性和可靠性；S6、叶绿体基因组的利用利用在线分析软件DOGMA进行叶绿体的注释；利用MAUVE软件分析叶绿体基因组的结构差异，利用采用mVISTA工具对分析不同叶绿体全基因组的序列差异并寻找潜在的候选分子进化分析的位点；采用MEGA和PAML进行系统进化和分子选择分析。