[发明专利]一种简便、高效且通用的植物叶绿体基因组测序方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物科学领域，具体涉及一种简便、高效且通用的植物叶绿体基因组测序方法。

背景技术

叶绿体是绿色植物细胞内所特有的细胞器，是细胞进行光合作用的场所，是一切能量的最初来源。叶绿体拥有自身的DNA和遗传体系，与生物进化与及细胞起源有很密切关系，叶绿体基因组是分子进化、系统发育和分子标记领域的重要研究对象，而获得目的生物的叶绿体基因组全序列，则成为该领域研究人员的首要目标。传统的植物叶绿体基因组测序通常采用通用引物长链PCR或是叶绿体基因组文库的叶绿体基因组测序策略，一般都要求大量新鲜材料、提取较高纯度的叶绿体DNA，操作步骤多，流程复杂，周期长，而且分离高纯度的叶绿体DNA需要根据不同植物物种的特性优化体系，难度较大，通用性差，往往成为叶绿体基因组测序的限制因素。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种简便、高效且通用的植物叶绿体基因组测序方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种简便、高效且通用的植物叶绿体基因组测序方法，包括如下步骤：

S1、直接分离、纯化植物叶片的基因组DNA

为保证基因组DNA有足够的叶绿体DNA，将植株在强光下曝光2天后，选择较深绿色的叶片100mg，利用常规微量DNA提取方法(如CTAB)提取叶片的基因组DNA(不用预先分离叶绿体，再提取叶绿体DNA等繁琐的实验步骤)，保存于低温备用；

S2、基因组DNA的高通量文库构建及测序

取上述提取的基因组DNA 5ug，采用超声波进行物理随机打断或者dsDNA水解酶进行酶切，然后用MinEITte PCR回收试剂盒(Qiagen，德国)回收片段化的叶绿体DNA，再将片段化的DNA末端补齐，并加上测序接头，用MinElute PCR回收试剂盒回收加上接头的DNA，电泳并利用胶回收试剂盒(Tiangen，China)回收200-500bp的片段，PCR扩增回收片段构建测序文库；测序文库构建和测序反应采用IIITmina公司的标准程序(IIIumina，USA)，测序平台为IIIumina Hiseq4000，文库大小为300bp，测序策略为PE150(测序平台和策略可随意调整，适用于任意高通量测序平台)；

S3、测序数据的预处理

测序后采用IIIumina HCS 1.1软件进行测序图像的转换及质量值计算，将图像信息转变为序列信息，然后去除载体序列、低质量序列获得可用于候选分析的测序数据；然后从NCBI下载其所收录的所有植物叶绿体基因组序列(ftp：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/release/plastid)作为参考序列，将获得的测序数据利用botwie软件进行基因组映射，具体命令为bowtie2--al-conc alconc--un-conc unconc--un unpaired--al aligned-x all_plant_chloroplast_sequence-1 clean_data_P1-2 clean_data_P2-sout.sam，将能比对上参考基因组的左右两端序列分别放入到mapped_reads_p1和mapped_reads_p2文件中，用于候选的叶绿体基因组组装(数据分析标准化)；

S4、叶绿体基因组的组装和拼接

对上述步骤得到mapped reads数据集，利用soapdenovo软件对得到的reads进行从头拼装得到序列contigs，然后利用Pair-end关系对contigs进行连接，再用gapcloser进行补洞，得到scaffold序列，然后再用所有mapped reads映射(mapping)所有scaffold，再一次填补空缺(gap)位置；同时，选择与目标物种近缘关系最近的已测序的叶绿体为参考，利用MAQ软件将mapped reads对参考基因组进行映射(mapping)，得到一条一致序列(Consensus sequence)。然后利用blat工具将拼接得到的scaffold序列按照参考基因组进行排序，空缺区域用consensus序列对应位置填补，得到叶绿体基因组的草图；最后，再用所有mapped reads映射(mapping)草图，补可能的空缺位置，最终得到叶绿体基因组精细图；(采用高通量测序可以十分经济的方式获得超高深度覆盖度的测序结果，拼接操作十分简单而且准确度高)。

S5、叶绿体基因组的验证和评估