[发明专利]一个诱导大蒜愈伤组织四倍体及再生试管鳞茎的方法

摘要

本发明公开了一种诱导大蒜愈伤组织四倍体及再生试管鳞茎的方法。主要采用宝坻大蒜鳞茎作为外植体诱导愈伤组织，用秋水仙素作为诱导剂诱导大蒜愈伤组织染色体加倍：秋水仙素浓度为0.2%，处理时间为18小时，此时四倍体诱导率达到最高为36.36%。加倍处理后的愈伤组织经过恢复培养并继代，继代培养基为：MS+1.5 mg·L‑12,4‑D+0.5 mg·L‑1KT+30g·L‑1蔗糖+7.5 g·L‑1琼脂，pH=5.8；继代2次的愈伤组织诱导再分化，再分化培养基为：MS+3 mg·L‑16‑BA+30g·L‑1蔗糖+7.5g·L‑1琼脂，pH=5.8；再分化的试管苗接入试管鳞茎诱导培养基上诱导试管鳞茎，试管鳞茎诱导培养基为：MS+120g·L‑1绵白糖+6.8g·L‑1琼脂，pH=7.5。该方法为大蒜多倍体育种提供依据，通过试管鳞茎途径再生提高了组培苗的成活率。

主权项

1.一个诱导大蒜愈伤组织四倍体及再生试管鳞茎的方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）以大蒜鳞茎片为外植体诱导愈伤组织及继代：选取没有病斑的大蒜鳞茎剥去外皮后自来水冲洗30 min，然后于紫外灭菌后的超净工作台中用0.1%（w/w）的 HgCl2浸泡20 min，无菌蒸馏水洗涤2‑3次，75%（w/w）的酒精浸泡10 min，无菌蒸馏水洗涤3‑5遍备用；将大蒜鳞茎切成0.5‑0.8 cm厚的片，接到诱导愈伤组织培养基上：MS + 1.5 mg · L‑1 2,4‑D + 0.5 mg · L‑1 KT + 30 g · L‑1蔗糖 + 7.5 g · L‑1琼脂，pH=5.8，当诱导出淡黄色颗粒状的愈伤组织并且愈伤组织足够多时进行继代培养；（2）秋水仙素诱导愈伤组织加倍体系构建：愈伤组织继代两次后，用浓度为0.2%（w/w）秋水仙素，处理时间为18小时，四倍体诱导率达到最高为36.36%；（3）秋水仙素处理愈伤组织再分化不定芽：用最佳诱导体系的秋水仙素浸泡处理愈伤组织，无菌蒸馏水冲洗干净后接入继代培养基进行恢复培养，恢复培养和继代培养基均为MS + 1.5 mg · L‑1 2,4‑D + 0.5 mg · L‑1 KT + 30 g · L‑1蔗糖 + 7.5 g · L‑1琼脂，pH=5.8；4周后将生长旺盛的愈伤组织转移至再分化培养基诱导不定芽，再分化培养基为MS + 3 mg · L‑1 6‑BA + 30 g · L‑1蔗糖 + 7.5 g · L‑1琼脂，pH=5.8；（4）试管鳞茎诱导与收获将长至5‑8 cm的试管苗移入诱导试管鳞茎培养基，其培养基为MS + 120 g · L‑1 绵白糖 + 6.8 g · L‑1琼脂， pH=7.5，试管鳞茎成熟后取出，清洗表层培养基后阴干，放4 ℃冰箱低温储存。