[发明专利]一个诱导大蒜愈伤组织四倍体及再生试管鳞茎的方法

说明书

本发明公开了一种诱导大蒜愈伤组织四倍体及再生试管鳞茎的方法。主要采用宝坻大蒜鳞茎作为外植体诱导愈伤组织，用秋水仙素作为诱导剂诱导大蒜愈伤组织染色体加倍：秋水仙素浓度为0.2%，处理时间为18小时，此时四倍体诱导率达到最高为36.36%。加倍处理后的愈伤组织经过恢复培养并继代，继代培养基为：MS+1.5 mg·L^‑12,4‑D+0.5 mg·L^‑1KT+30g·L^‑1蔗糖+7.5 g·L^‑1琼脂，pH=5.8；继代2次的愈伤组织诱导再分化，再分化培养基为：MS+3 mg·L^‑16‑BA+30g·L^‑1蔗糖+7.5g·L^‑1琼脂，pH=5.8；再分化的试管苗接入试管鳞茎诱导培养基上诱导试管鳞茎，试管鳞茎诱导培养基为：MS+120g·L^‑1绵白糖+6.8g·L^‑1琼脂，pH=7.5。该方法为大蒜多倍体育种提供依据，通过试管鳞茎途径再生提高了组培苗的成活率。

本发明得到天津市农委重点资助项目（201302030）；天津师范大学应用开发研究基金重点项目资助（52XK1210，52XK1505）。

技术领域

本发明属于农业生物工程技术领域，涉及大蒜组织培养与快繁的方法，更具体的说是构建一种诱导大蒜愈伤组织四倍体及再生试管鳞茎的方法。

背景技术

大蒜(Allium sativum L.)是百合科葱属一年生草本植物，在我国种植历史悠久，栽培广泛。大蒜为二倍体植株，其染色体数为 2n=16，主要以肥大的肉质鳞茎和鲜嫩的花茎器官为产品。大蒜品种资源较为丰富，但由于长期进行无性繁殖，无法杂交育种，大蒜的遗传学和生物学多样性不能够得到充分利用，同时一些优良种质也因种性退化而濒临灭绝，因此大蒜的种质资源创新和新品种培育势在必行。自1937年开创倍性育种先河以来，全球掀起了多倍体育种热潮。多倍体育种是近代作物育种常用方法之一，对改良无性繁殖作物的营养器官具有明显的优越性。多倍体植株最明显的特征是相对的“巨大化”、植物生物量及次级代谢产物量高、适应性和抗逆性强等特点。因此，多倍体育种可以提高作物产量、改善作物产品品质、增强作物的抗逆性，是作物品种改良的重要途径。常规多倍体诱导技术由于诱变发生在单个细胞中，整体植株或器官为材料时常产生嵌合体现象，诱变率低，受环境干扰大，畸变率高，可能发生回复突变等。而以植物愈伤组织作为诱变材料，在离体条件下染色体加倍具有显著的优越性：试验条件容易控制，试验结果重复性强，工作效率高，嵌合体发生率低，因此，离体组织的染色体加倍日益受到重视。作为潜在的多倍体育种优势材料，大蒜多倍体育种研究也受到关注，但进展缓慢。目前大蒜的多倍体育种研究，已经实现了采用大蒜茎尖、根尖、花苞等为材料经秋水仙素处理后获得染色体加倍的效果，部分研究获得了染色体加倍的再生植株，但利用大蒜愈伤组织进行多倍体细胞诱导的研究鲜有报道。愈伤组织繁殖系数高，以愈伤组织为诱变材料，处理离体培养的细胞，为大蒜多倍体育种提供了新的途径。化学诱变是多倍体技术诱导普遍采用的方法之一，目前已报道的多倍体诱导剂多属于有丝分裂中期抑制剂，其中秋水仙素是诱导植物细胞染色体加倍最普遍的药剂。已报道的研究中，直接将大蒜再生植株试管苗种植于田间，需较大的人力物力，在生长过程中纤细脆弱，移栽成活率很低，致使大蒜品种改良技术仍受到限制，难以推广。而将试管苗先诱导形成试管鳞茎后无需驯化，可直接将小鳞茎移栽到大田中，易于管理，能明显提高试管苗的移栽成活率。

本发明以宝坻大蒜“六瓣红”的鳞茎片作为外植体诱导的愈伤组织，以不同浓度的秋水仙素作为诱导剂，诱导大蒜愈伤组织染色体加倍，获得四倍体愈伤组织细胞；对加倍后的愈伤组织诱导再分化，再分化的试管苗诱导成试管鳞茎。该的方法为大蒜多倍体育种提供依据，通过试管鳞茎途径再生提高了组培苗的成活率。

发明内容

本发明的目的在于公开了一种诱导大蒜愈伤组织四倍体及再生试管鳞茎的方法，它是按如下的步骤进行:

（1）以大蒜鳞茎片为外植体诱导愈伤组织及继代