[发明专利]一种基于二维多孔晶体氮掺杂碳材料的富集分离糖肽的方法

摘要

本发明涉及材料分析化学和翻译后修饰蛋白组学等领域。本发明涉及一种糖肽的分离富集方法，该方法是使用一种具有二维多孔晶体结构的高掺氮量的碳材料与蛋白酶解物接触，利用材料与糖肽间的亲水作用、静电作用、CH3‑π等作用，采用固相萃取(SPE)或者分散固相萃取(dSPE)分离模式分离富集糖肽，并对样品进行质谱分析。该方法通过优化上样液、淋洗液和洗脱液的组成、酸碱性、缓冲盐等参数，实现了对糖肽的选择性富集。该方法具有稳定性好、选择性高、吸附量大、灵活性强、操作简便可控等优点，可用于标准品和复杂样品的糖肽富集。

主权项

1.一种基于二维多孔晶体氮掺杂碳材料的富集分离糖肽的方法，其特征在于，是将二维多孔晶体氮掺杂碳材料与蛋白酶解物接触，采用柱固相萃取模式或分散固相萃取模式分离富集糖肽。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述二维多孔晶体氮掺杂碳富集材料结构式示意为：

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述二维多孔晶体氮掺杂碳材料是由1,2,3,4,5,6‑苯六胺和环己六酮充当氮源及碳源，于N‑甲基吡咯烷酮或三氟甲基磺酸溶液中170－180℃聚合得到。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：将所述二维多孔晶体氮掺杂碳材料作为富集材料，采用柱固相萃取模式(SPE)和分散固相萃取模式(dSPE)富集和纯化糖肽；

在SPE模式下，首先将二维多孔晶体氮掺杂碳材料加载到末端带有筛板的移液枪枪头或者SPE小柱上，采用洗脱液冲洗材料，之后用上样液平衡材料，然后将溶解在上样液中的样品加载到富集材料上，之后采用淋洗液冲洗材料除去非糖肽，最后用洗脱液洗脱材料上的糖肽；

在dSPE下，将富集材料置于离心管中，采用洗脱液冲洗材料，然后用上样液平衡材料，之后把材料与溶解在上样液中的样品混合，孵化后，离心弃上清液，所剩沉淀部分用淋洗液冲洗，震荡后，离心取上清液，浓缩即为非糖肽，沉淀部分用洗脱液洗脱糖肽，震荡后，离心取上清液浓缩即得糖肽。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：

上样液组成为缓冲盐溶液或酸水溶液与有机溶剂的混合液，有机溶剂的体积比例为70‑90％，pH在1‑5范围内，缓冲盐的浓度为0‑200mM，酸水溶液中酸的质量浓度为0.1％‑5％；

淋洗液组成为缓冲盐溶液或酸水溶液与有机溶剂的混合液，有机溶剂的体积比例为55‑80％，pH＝1‑5，缓冲盐的浓度为0‑200mM，酸水溶液中酸的质量浓度为0.1％‑5％；

洗脱液组成为缓冲盐溶液或酸水溶液与有机溶剂的混合液，有机溶剂的体积比例为0‑50％，pH值在0‑5或10‑14范围内，缓冲盐的浓度为0‑500mM，酸水溶液中酸的质量浓度为0.1％‑5％。

6.按照权利要求5所述方法，其特征在于，所用的蛋白酶解液应旋干去盐，重溶于上样液，样品的上样量与二维多孔晶体氮掺杂碳材料量之间的体积比例为1:3‑1:1000，实验操作温度为15‑50摄氏度。

7.按照权利要求4或5所述方法，其特征在于，采用SPE模式富集糖肽，冲洗材料所用洗脱液的体积为材料体积的3‑50倍，平衡材料所用的上样液体积材料体积的3‑50倍，上样体积为材料体积的5‑200倍，淋洗材料所用的淋洗液体积为材料体积的5‑100倍，洗脱糖肽所用的洗脱液体积为材料体积的5‑30倍；采用dSPE模式富集糖肽，冲洗材料所用洗脱液的体积为材料体积的3‑500倍，平衡材料所用的上样液体积材料体积的3‑500倍，上样体积为材料体积的3‑1000倍，淋洗材料所用的淋洗液体积为材料体积的3‑1000倍，洗脱糖肽所用的洗脱液体积为材料体积的5‑200倍。

8.按照权利要求4或5所述方法，其特征在于，采用dSPE模式富集糖肽，振荡转数为100‑2500rpm，样品与材料之间的孵化时间为10‑120分钟，孵化温度为15‑50摄氏度。

9.按照权利要求4或5所述方法，其特征在于，有机溶剂包括但不局限于乙腈、甲醇、乙醇等中的一种或二种以上，缓冲盐包括但不局限于甲酸铵，乙酸铵，碳酸氢铵等，酸包括但不局限于甲酸、乙酸、三氟乙酸等中的一种或二种以上。