[发明专利]一种基于二维多孔晶体氮掺杂碳材料的富集分离糖肽的方法

说明书

本发明涉及材料分析化学和翻译后修饰蛋白组学等领域。本发明涉及一种糖肽的分离富集方法，该方法是使用一种具有二维多孔晶体结构的高掺氮量的碳材料与蛋白酶解物接触，利用材料与糖肽间的亲水作用、静电作用、CH3‑π等作用，采用固相萃取(SPE)或者分散固相萃取(dSPE)分离模式分离富集糖肽，并对样品进行质谱分析。该方法通过优化上样液、淋洗液和洗脱液的组成、酸碱性、缓冲盐等参数，实现了对糖肽的选择性富集。该方法具有稳定性好、选择性高、吸附量大、灵活性强、操作简便可控等优点，可用于标准品和复杂样品的糖肽富集。

技术领域

本发明涉及材料分析化学和翻译后修饰蛋白组学领域，尤其涉及一种富集分离糖肽的方法。

技术背景

蛋白质的糖基化是生物体内最重要、最常见的翻译后修饰之一，与细胞粘附、信号转导、细胞凋亡、免疫应答[2-4]等生物学过程及生理机能密切相关。糖蛋白作为重要的生物标志物，目前已被广泛应用于疾病的诊断、预警和药效评价[5]。目前对糖蛋白酶解物中的糖肽结构进行质谱分析是获取蛋白质糖基化信息的主要手段，其面临的问题是：由于糖肽离子化效率低，数量又仅占所有酶解后肽段的2％～5％[6]，其质谱响应很容易被高丰度非糖肽所抑制。并且由于糖链的微不均一性，同一糖基化位点上，糖链的类型可达几十种，进一步降低了糖肽的相对量而使其很难被检测到。因此，需要在质谱检测前对糖肽进行选择性富集。现有的糖肽富集方法主要有凝集素亲合法、酰肼化学法、亲水作用色谱法、硼亲和法等[7-10]，每种方法各有其缺点和局限性，例如凝集素只针对特定的糖型，糖肽的覆盖范围小；酰肼化学法操作繁琐；亲水作用色谱法存在亲水性材料糖肽选择性不足的问题等。

因此，有必要开发更高效、高选择性及稳定性的糖肽富集新材料及新方法。

二维有序晶体结构材料是近几年功能材料研发的热点之一，本发明所采用的二维多孔晶体氮掺杂碳材料，其制备方法于2015年首次见诸报道[1]，因其新颖的制备方法、独特的结构和电子性质，被认为是一种在吸附、储氢、电池、传感等领域具有潜力的新型功能材料。而将其应用于样品预处理，特别是标准品及复杂样品中糖肽的富集，尚属首次。申请人认为由于该二维多孔晶体氮掺杂碳材料具有独特的2D片层结晶结构而具有超大比表面积和丰富的微孔，吸附量大；表面有氨基、羧基等亲水基团；并且由于氮原子的引入，引起表面局部电子密度的改变，其独特的物理化学性质及电负性，使其成为一种具有潜力的高效富集糖肽的新型材料。本发明采用SPE及dSPE等模式，通量高，方法灵活，操作简便，并且通过优化酸、缓冲盐及上样液、淋洗液、洗脱液的组成及比例，实现了对糖蛋白酶解物中糖肽的高选择性富集。

参考文献：

[1]J.Mahmood,E.Lee,M.Jung,D.Shin,I.Jeon,S.Jung,H.Choi,J.Seo,S.Bae,S.Sohn,N.Park,J.Oh,H.Shin and J.Baek,Nat.Commun.,6(2015)6486.

[2]M.Taichi,S.Kitazume,K.Vong,R.Imamaki,A.Kurbangalieva,N.Taniguchi,K.Tanaka,Glycoconjugate J.,7(2015)497.

[3]H.Cai,F.Degliangeli,B.Palitzsch,B.Gerlitzki,H.Kunz,E.Schmitt,R.Fiammengo,U.Westerlind,Bioorg.Med.Chem.Lett.,5(2016)1132.

[4]A.Joshi,M.Sedano,B.Beauchamp,E.Punke,Z.Mulla,A.Meza,O.Alozie,D.Mukherjee,H.Garg,Clin.Dev.Immunol.,4(2016)1768.