[发明专利]一种β-葡萄糖苷酶突变体蛋白的表达载体及表达工程菌和表达方法有效
| 申请号： | 201610838951.5 | 申请日： | 2016-09-21 |
| 公开（公告）号： | CN106282217B | 公开（公告）日： | 2019-12-06 |
| 发明（设计）人： | 肖亚中;常飞;方泽民;房伟 | 申请（专利权）人： | 安徽大学 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12N15/66;C12N1/21;C12N9/42;C12R1/19 |
| 代理公司： | 34148 合肥兴东知识产权代理有限公司 | 代理人： | 王伟<国际申请>=<国际公布>=<进入国 |
| 地址： | 230601 安徽省*** | 国省代码： | 安徽;34 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种β‑葡萄糖苷酶突变体蛋白的表达载体，按以下方法构建而成：(1)克隆β‑葡萄糖苷酶突变体蛋白的DNA序列；(2)克隆光敏调控单元的DNA序列；(3)将切割得到的β‑葡萄糖苷酶突变体蛋白的DNA酶切片段和光敏调控单元的DNA酶切片段连接至pET22b(+)载体上，即得所述β‑葡萄糖苷酶突变体蛋白的表达载体。本发明通过插入光敏调控单元构建得到可光诱导的表达载体，该表达载体可通过光照手段对β‑葡萄糖苷酶突变体蛋白进行诱导表达，与传统的诱导表达方法相比，光照诱导方法具有表达量高、无外源添加物的特点，此外光照诱导方法对蛋白的表达强度可通过光照强度进行控制，且不影响后续纯化步骤。 | ||
| 搜索关键词： | 葡萄糖苷酶 突变体蛋白 表达载体 调控单元 光敏 光照诱导 诱导表达 切片 构建 光照 克隆 添加物 表达量 传统的 段连接 光诱导 无外源 切割 蛋白 | ||
【主权项】：
1.一种利用表达β-葡萄糖苷酶突变体蛋白的工程菌进行高密度发酵生产β-葡萄糖苷酶突变体蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：将表达β-葡萄糖苷酶突变体蛋白的工程菌接种在TB培养基中进行避光培养，当培养基中甘油耗尽、发酵液溶氧DO上升幅度超过30％时，添加补料培养基，当发酵液OD600为10-25时，再加入光照，诱导β-葡萄糖苷酶突变体蛋白的表达；所述TB培养基的组成为：甘油15-20g·L-1，酵母粉20-26g·L-1，胰蛋白胨10-12g·L-1，KH2PO4 17mM，K2HPO4 72mM，氨苄青霉素100μg·mL-1；所述补料培养基的组成为：甘油450-500g·L-1，酵母粉40-50g·L-1，胰蛋白胨40-50g·L-1，氨苄青霉素100μg·mL-1；/n所述表达β-葡萄糖苷酶突变体蛋白的工程菌是通过将β-葡萄糖苷酶突变体蛋白的表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中所获得，所述β-葡萄糖苷酶突变体蛋白的表达载体按以下方法构建而成：/n(1)克隆β-葡萄糖苷酶突变体蛋白的DNA序列，该β-葡萄糖苷酶突变体蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；/n(2)克隆光敏调控单元的DNA序列，该光敏调控单元的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；/n(3)通过双酶切的方法分别切割上述克隆得到的β-葡萄糖苷酶突变体蛋白的DNA和光敏调控单元的DNA，并将切割得到的β-葡萄糖苷酶突变体蛋白的DNA酶切片段和光敏调控单元的DNA酶切片段连接至pET22b(+)载体上，即得所述β-葡萄糖苷酶突变体蛋白的表达载体。/n
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