[发明专利]一种β-葡萄糖苷酶突变体蛋白的表达载体及表达工程菌和表达方法

说明书

本发明公开了一种β‑葡萄糖苷酶突变体蛋白的表达载体，按以下方法构建而成：(1)克隆β‑葡萄糖苷酶突变体蛋白的DNA序列；(2)克隆光敏调控单元的DNA序列；(3)将切割得到的β‑葡萄糖苷酶突变体蛋白的DNA酶切片段和光敏调控单元的DNA酶切片段连接至pET22b(+)载体上，即得所述β‑葡萄糖苷酶突变体蛋白的表达载体。本发明通过插入光敏调控单元构建得到可光诱导的表达载体，该表达载体可通过光照手段对β‑葡萄糖苷酶突变体蛋白进行诱导表达，与传统的诱导表达方法相比，光照诱导方法具有表达量高、无外源添加物的特点，此外光照诱导方法对蛋白的表达强度可通过光照强度进行控制，且不影响后续纯化步骤。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体地说涉及一种β-葡萄糖苷酶突变体蛋白的表达载体及表达工程菌和表达方法。

背景技术

β-葡萄糖苷酶(EC 3.1.2.21，β-glucosidase)属于纤维水解酶类，主要水解糖苷或者寡糖中的β-1,4-糖苷键，同时释放出末端非还原性的葡萄糖以及糖苷配体，在现代工业生物技术如食品、医药、饲料加工、能源炼制等领域具有重要应用价值。目前细菌β-葡萄糖苷酶普遍采用异源表达的生产方法，又以大肠杆菌为主要表达宿主菌。然而，常用的大肠杆菌诱导表达方法存在诸多问题，如诱导剂IPTG价格昂贵、存在一定的细胞毒性；大量蛋白多在胞内表达，需要专用仪器对细胞壁和细胞膜进行破碎，增加了后续纯化步骤和纯化难度。因此，开发新的β-葡萄糖苷酶在大肠杆菌中的诱导表达方法，不仅有利于促进β-葡萄糖苷酶的生产和开发，也能为其它蛋白在大肠杆菌中的异源表达提供思路和借鉴。

光照是一种易于控制的诱导方法，利用光照的方法调控目的基因的表达能够减少发酵过程中的操作步骤，减少可能造成的外源污染，降低目的蛋白的生产成本。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种诱导简单、表达量高、无需外源添加物的β-葡萄糖苷酶突变体蛋白的表达载体。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种β-葡萄糖苷酶突变体蛋白的表达载体，按以下方法构建而成：

(1)克隆β-葡萄糖苷酶突变体蛋白的DNA序列，该β-葡萄糖苷酶突变体蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)克隆光敏调控单元的DNA序列，该光敏调控单元的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；

(3)通过双酶切的方法分别切割上述克隆得到的β-葡萄糖苷酶突变体蛋白的DNA和光敏调控单元的DNA，并将切割得到的β-葡萄糖苷酶突变体蛋白的DNA酶切片段和光敏调控单元的DNA酶切片段连接至pET22b(+)载体上，即得所述β-葡萄糖苷酶突变体蛋白的表达载体。

本发明所表达的β-葡萄糖苷酶突变体蛋白相较于野生型β-葡萄糖苷酶，其乙醇耐受浓度IC50提高1.8倍，且葡萄糖耐受浓度提高2倍，pH及温度稳定性也有所提高，该突变体蛋白能够在较短时间内高效水解大豆异黄酮糖苷制备苷元，具有潜在应用价值。

而本发明通过插入光敏调控单元构建得到可光诱导的表达载体，该表达载体可通过光照手段对β-葡萄糖苷酶突变体蛋白进行诱导表达，与传统的诱导表达方法相比，光照诱导方法具有表达量高、无外源添加物的特点，此外光照诱导方法对蛋白的表达强度可通过光照强度进行控制，且不影响后续纯化步骤。

本发明还提供一种表达β-葡萄糖苷酶突变体蛋白的工程菌，是通过将上述β-葡萄糖苷酶突变体蛋白的表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中所获得。

大肠杆菌由于其遗传学、生物化学和分子生物学等方面已充分被人们了解而成为表达异源蛋白的首选表达系统。大肠杆菌容易培养且费用低、对多种蛋白具有良好的耐受能力、能高水平的表达异源蛋白，而且光照对大肠杆菌无毒性；同时，大肠杆菌可进行高密度发酵，可进一步降低生产成本。因此，利用大肠杆菌工程菌异源表达β-葡萄糖苷酶具有单位产量高、生产周期短等优势。