[发明专利]一种提高扩增子文库数据均一性的文库构建方法

摘要

本发明属于高通量基因测序领域，本发明提供了一种提高扩增子文库数据均一性的文库构建方法，包括：1)确定多个目标区域的扩增子序列并设计引物；2)将引物划分为多个反应管；3)计算每条引物的起始用量，保证每个扩增子得到均一化扩增；4)用每个反应管的引物混合物对目标区域进行第1轮扩增；5)对所得到的扩增子进行纯化和定量；6)将所述每个反应管的扩增子进行混合，使得各个扩增子的数目大致相当；7)以混合后的扩增子混合物为模板进行第2轮PCR反应，将测序接头P5和P7引入到扩增子的两侧；8)对扩增子文库进行纯化、定量、测序。

主权项

1.一种提高扩增子文库数据均一性的文库构建方法，所述方法包括如下步骤：1)确定多个目标区域的扩增子序列，并针对每个所述多个扩增子序列分别设计多重引物，所述多重引物的5’端含有通用序列，为测序接头序列3’端的一部分；2)将多重引物划分为多个反应管，每个反应管内的多重引物满足：a)每个反应管内所有引物的解链温度的标准差≤5℃；b)反应管内引物的平均解链温度Tprimer–二聚体的解链温度Tdimer≥10℃；c)反应管内目标扩增子引物的平均解链温度Tprimer–非特异扩增子引物的解链温度Tnon‑specific≥10℃；d)将扩增子之间进行两两比对，并对比对结果计算热力学解链温度Tpp，反应管内目标扩增子引物的平均解链温度Tprimer–Tpp≥10℃；3)计算每条引物的起始用量，使每个扩增子得到均一性扩增，得到的扩增子浓度差别不大于20％，并根据步骤2)中划分的反应管制备每个反应管的多重引物混合物；4)用每个反应管的多重引物混合物对目标区域序列进行第1轮扩增，得到扩增子，并将通用序列引入到扩增子的两侧；5)对步骤4)获得的每个反应管的扩增子进行纯化和定量；6)将所有所述反应管的扩增子进行混合，并使得各个扩增子的数目相差在10％以内；7)以混合后的扩增子混合物为模板、以测序接头引物进行第2轮PCR反应，将测序接头引入到扩增子的两侧；8)对扩增子文库进行纯化、定量、测序。