[发明专利]一种提高扩增子文库数据均一性的文库构建方法

说明书

本发明属于高通量基因测序领域，本发明提供了一种提高扩增子文库数据均一性的文库构建方法，包括：1)确定多个目标区域的扩增子序列并设计引物；2)将引物划分为多个反应管；3)计算每条引物的起始用量，保证每个扩增子得到均一化扩增；4)用每个反应管的引物混合物对目标区域进行第1轮扩增；5)对所得到的扩增子进行纯化和定量；6)将所述每个反应管的扩增子进行混合，使得各个扩增子的数目大致相当；7)以混合后的扩增子混合物为模板进行第2轮PCR反应，将测序接头P5和P7引入到扩增子的两侧；8)对扩增子文库进行纯化、定量、测序。

技术领域

本发明属于高通量基因测序领域，具体而言，本发明涉及一种用于提高扩增子文库数据均一性的文库构建方法。

背景技术

扩增子捕获测序技术是一种靶向捕获测序技术，主要利用多重PCR技术对多个目标区域序列进行特异性扩增和富集，得到目标区域的扩增子，然后采用二代测序技术对扩增子进行测序，获取目标区域的序列信息。扩增子捕获测序技术与液相芯片杂交技术相比，具有文库构建周期短、测序深度高、成本低、panel设计灵活等优点，因此基于该技术开发出来的测序产品在靶向测序领域越来越受到消费者的欢迎和青睐。

尽管扩增子捕获测序技术优点众多，但是也存在一些不足，其突出缺点就是文库数据均一性差，具体表现为扩增子测序深度高低不一、参差不齐、标准差大。文库均一性差会带来两个严重问题：第1是显著增加测序的成本：在靶向测序领域，通常要求每个扩增子都达到某个可信测序深度，从而保证数据分析结果的可靠性。均一性差表明文库中有大量的扩增子低于可信测序深度，因此需要增大测序数据总量，将它们的测序深度提高到可信测序深度，这无疑增加了测序的成本。均一性差同时还表明文库中有多个扩增子的测序深度显著高于可信测序深度。这些高出可信测序深度的数据本质上属于冗余的无效数据，实际上降低了测序数据的利用率，增加了测序的成本。第二个严重问题是限制扩增子文库的通量。大量研究结果表明，随着扩增子通量的增加，引物二聚体和非特异性条带大量产生，导致文库的均一性急剧下降。综上所述，提高文库的均一性已经成为扩增子捕获测序技术领域亟待解决的问题，也是进一步降低扩增子测序费用、提高扩增子通量必须迈过的难关。

对于文库均一性差产生的原因，目前的主流观点认为是由内因和外因所致。内因主要是扩增子的扩增效率不同，导致扩增子经过相同循环数后积累的数量高低不一。进一步研究发现，扩增子的扩增效率很大程度上受引物序列和引物数量的影响，比如某些引物序列更易被DNA聚合酶识别和结合，从而导致该扩增子的数量增多；增多某些引物序列的数量则通常会提高相应扩增子的数量。外因主要是引物二聚体、非特异性条带和靶条带序列互补形成的融合体，因为它们的产生不但会消耗目标扩增子所需要的引物，同时也会消耗反应体系的底物和DNA聚合酶，导致目标扩增子数量急剧下降。需要强调的是，它们对均一性的影响能力随着扩增子通量的增高而显著增强。