[发明专利]可提高甘草黄酮含量的光果甘草愈伤组织细胞培养方法

摘要

本发明涉及可提高甘草黄酮含量的光果甘草愈伤组织细胞培养方法，其特征在于采用以下步骤：1）挑选饱满的光果甘草种子，在含有30g/L蔗糖、7g/L琼脂的MS基础培养基上培养得到无菌苗，接入愈伤组织诱导培养基中培养，后转入继代培养基中继代培养；2）选取步骤1）中继代培养后所获得的淡黄色愈伤组织，转移至液体培养基中悬浮振荡培养；3）在步骤2）所述愈伤组织悬浮振荡培养过程中，进行诱导培养，从继代培养周期的第6~12天开始，将培养温度从25^oC提高至35~45^oC，继续培养1~3天后，恢复培养温度到25^oC；在35~45^oC培养时，加入冠毒素；恢复至25^oC后，加入对羟基苯丙酮酸，悬浮振荡培养结束后得到甘草黄酮含量高的光果甘草愈伤组织细胞。有益效果：高甘草黄酮含量高。

主权项

1.提高甘草黄酮含量的光果甘草愈伤组织细胞培养方法，其特征在于采用以下步骤：1）光果甘草愈伤组织的诱导与继代培养：挑选饱满的光果甘草种子，在含有30g/L蔗糖、7g/L琼脂的MS基础培养基上培养得到无菌苗；取无菌苗胚轴为外植体，接入愈伤组织诱导培养基中黑暗培养10天，诱导出愈伤组织，之后在光照强度为1500 lx的条件下继续培养14天，每日光照12h；然后将愈伤组织转入继代培养基中，每28天继代一次，继代培养2次，以获得稳定的光果甘草愈伤组织，继代培养温度25^oC，继代培养基pH 5.8；所述愈伤组织诱导培养基为含有1~2mg/L萘乙酸、0.1~0.5mg/L 6‑苄氨基嘌呤、20~30g/L蔗糖、5~8g/L琼脂的MS基础培养基；所述继代培养基由愈伤组织诱导培养基中添加甲硫氨酸而成，甲硫氨酸在继代培养基中的浓度为0.1~1.0 mmol/L；2）愈伤组织悬浮振荡培养：选取步骤1）中生长旺盛、质地松散的淡黄色愈伤组织，转移至液体培养基中悬浮振荡培养，接种量40~100g/L，g/L=愈伤组织鲜重/液体培养基体积，摇床转速60~150 rpm，光照强度1500~2000 lx，光照时间8~16 h/天，液体培养基pH 5.6~6.8；每21天继代培养1次，继代培养2~5次；所述液体培养基是添加有6‑苄氨基嘌呤、萘乙酸、2，4‑二氯苯氧乙酸、蔗糖的MS基础培养基，所述6‑苄氨基嘌呤的浓度为1.0~2.0mg/L，萘乙酸的浓度为0.5~1.0mg/L，2，4‑二氯苯氧乙酸的浓度为0.5~1.0mg/L、蔗糖的浓度为20~30g/L；3）甘草黄酮的诱导积累：在步骤2）所述愈伤组织悬浮振荡培养过程中，还对其进行诱导培养，以刺激次生代谢产物甘草黄酮的积累，所述诱导条件为：于步骤2）所述继代培养周期的第6~12天开始，将培养温度从25^oC提高至35~45^oC，维持该温度继续培养1~3天后，恢复培养温度到25^oC，直至该培养周期结束；在35~45^oC培养时，往液体培养基中加入经过滤灭菌后的冠毒素，冠毒素终浓度为0.8~2.2mg/L；恢复至25^oC后，往液体培养基中加入经过滤灭菌后的对羟基苯丙酮酸，对羟基苯丙酮酸终浓度为60~150mg/L；悬浮振荡培养结束后得到甘草黄酮含量高的光果甘草愈伤组织细胞。