[发明专利]抗IL-4R单链抗体的制备方法及其在抗肿瘤上的应用

摘要

本发明公开了一种抗IL‑4R单链抗体的制备方法及其在抗肿瘤上的应用，其制备方法包括动物免疫、构建pCANTAB5E‑scFv重组质粒、构建抗IL‑4R抗体库、噬菌体抗体库的富集与筛选、scFv序列优化和pET‑32a‑scFv重组质粒的构建、pET‑32a‑scFv重组质粒酶切鉴定、cFv重组蛋白的表达、SDS‑PAGE分析、表达蛋白的复性与纯化和Western blot分析等步骤。本发明建立了稳定而特异抗IL‑4R单链抗体的制备方法，可用于以纯化蛋白在体内外对肺癌进行干预，为治疗肺癌提供新的实验依据，为进一步研制新型的抗肿瘤药物打下了良好的基础。

主权项

抗IL‑4R单链抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)动物免疫：取8只18～22g的BALB/c小鼠进行免疫，将100μg/mL的Human IL‑4R/CD124蛋白与Freund完全佐剂等体积混匀乳化进行初次免疫，腹部注射0.5mL乳剂/每只；2周后，对小鼠进行第1次加强免疫，2周后，对小鼠进行第2次加强免疫，1周后，眼眶取血和取脾脏，血液经过3500r/min离心15min，取血清，‑80℃保存，脾脏用RNA保存液，‑20℃保存；(2)构建pCANTAB5E‑scFv重组质粒：取40～80mg脾组织按照RNAiso Plus说明书方法操作提取总RNA；按照RevertAid First cDNA Synthesis kit说明书方法进行cDNA第1链合成；以逆转录产物cDNA为模板，重链、轻链可变区引物序列扩增目的基因V_H和V_L；以合成的linker单链为模板，采用linker引物序列扩增目的基因；将扩增出来的V_H、V_L和linker作为模板，以scFv引物序列，通过重叠延伸PCR反应体系拼接扩增scFv；参照Not Ⅰ酶和Sfi Ⅰ酶说明书分别对scFv与pCANTAB5E载体进行双酶切，参照T4连接酶说明书将双酶切过的scFv和pCANTAB5E载体进行插入连接；将pCANTAB5E‑scFv重组质粒转入感受态TG1细菌，在含有200g/L MgCl₂、50mg/L氨苄青霉素、20g/L葡萄糖的SOB‑AG固体培养基上37℃培养16h，取阳性重组质粒TG1单菌落进行菌落PCR鉴定，提取pCANTAB5E‑scFv重组质粒，按照Sfi Ⅰ酶和Not Ⅰ酶说明书操作进行双酶切鉴定；再取10个重组质粒，按照BstN Ⅰ内切酶说明操作进行抗体库多样性鉴定；(3)构建抗IL‑4R抗体库：取含有pCANTAB5E‑scFv重组质粒的转化菌1mL，加入含50mg/L氨苄青霉素、20g/L葡萄糖的2×YT‑AG液体培养基至10mL，在37℃、250r/min振荡培养至A₆₀₀≈0.5；加入辅助噬菌体M13K07，37℃、250r/min振荡1h，1000r/min离心10min弃上清；加入10mL 2×YT‑AK，37℃、250r/min振荡培养16h；1000r/min离心10min，取上清移至无菌15mL的离心管中，加入2mL PEG/NaCl混合液浓缩沉淀，置于冰上60min后离心弃上清；沉淀重悬于2mL含有20mg BSA的PBS溶液，用0.45μm滤膜过滤既获得噬菌体单链抗体库；取100μL噬菌体单链抗体库溶液，用2×YT‑AG液体培养基连续3次进行10倍稀释，3个稀释度各取100μL，分别加入900μL新鲜制备的E.coli TG1，室温放置15min，并分别涂布于SOB‑AG固体培养基上，37℃培养16h，计算抗体滴度；(4)噬菌体抗体库的富集与筛选：用PBS把重组人IL‑4R稀释到10μg/mL，取50μL稀释液包被96孔板，4℃孵育16h；每孔加入350μL PBS，清洗孔板后弃液，连续3次；用BSA‑PBS封闭微孔室温孵育1h；每孔加入350μL PBS洗孔，弃液，连续3次；加入经过聚乙二醇沉淀的噬菌体单链抗体库，50μL/孔，37℃孵育2h弃液；先用PBS每孔洗10次再用PBST每孔洗10次；加入pH＝2.2的Gly‑HCl洗脱液，50μL/孔；室温放置10min，迅速加入2mol/L，pH＝7.0的Tris 5μL/孔，吸取微孔板中的溶液到装有2mL TG1的15mL EP管中，室温放置20min；加入10mL 2×YT‑AG，37℃、250r/min振荡培养1h，加入4×10¹²噬斑形成单位的M13K07，并加入终剂量为50μg/mL的卡那霉素，37℃、250r/min振荡培养16h；离心沉淀细胞，用PEG/NaCl混合液沉淀细胞，并进行下一轮的富集筛选，如此“吸附‑洗脱‑感染扩增”共筛选3轮，选择抗原亲合力最强的克隆进行测序分析；(5)scFv序列优化和pET‑32a‑scFv重组质粒的构建：为实现scFv基因的成功表达进行优化scFv序列，删除scFv序列上的信号肽和E‑tag碱基；根据pET‑32a载体上的酶切位点，将scFv基因片段上以前的酶切位点Sfi Ⅰ和Not Ⅰ酶切位点更换为Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ，选择表达His‑tag作为检测标签；合成优化scFv基因片段并构建pET‑32a‑scFv重组质粒转导入感受态细胞E.coli BL21，取适量已转化的感受态细胞涂布含100μg/mL羧苄青霉素的TB平皿，37℃培养12～16h；(6)pET‑32a‑scFv重组质粒酶切鉴定：挑取单菌落至装有15mL TB培养液的100mL培养瓶中，于37℃环境下震荡培养至0D₆₀₀＝0.6～0.8，用高纯质粒小量制备试剂盒提取质粒；用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ对该质粒进行双酶切鉴定，酶切体系：重组质粒：10μL；内切酶Xho Ⅰ：2μL；10×Buffer Tango：2.5μL；ddH₂O：35.5μL；酶切反应：37℃酶切4h，80℃，20min灭活Xho Ⅰ酶，待冷却至12℃，再加入2μL EcoR Ⅰ内切酶，37℃酶切4h，65℃，灭活20min，取5μL做1％琼脂糖凝胶电泳；将成功酶切的质粒测序，将测序结果进行BLAST比对，对测序结果进行预测蛋白质氨基酸序列；(7)scFv重组蛋白的表达：挑取平板上的单个菌落接种至装有10mLTB培养基的50mL锥形瓶中，于37℃快速振荡培养至OD₆₀₀＝0.2～0.4，将菌液4000rpm离心15min，取菌体用新鲜的TB培养基重悬，4000rpm离心15min以去除β‑内酰胺酶，再用新鲜的TB培养基重悬，转移菌液至装有100mL TB培养基的500mL锥形瓶中，于37℃快速振荡培养至OD₆₀₀＝0.4～0.6，加入终浓度为1mM的IPTG于37℃快速振荡培养诱导重组蛋白表达3h，离心取沉淀加入细菌裂解液、蛋白酶混合抑制剂及溶菌酶等裂解的细菌，于4℃条件下13000rpm离心得到不溶性的包涵体；将包涵体重悬于含有8M尿素的Binding Buffer中，置于冰浴中使包涵体溶解，取100μL包涵体混合液作为样品进行SDS‑PAGE进行检测；(8)SDS‑PAGE分析：分别取诱导0h，1h，2h和3h时间段的样本用100μL PBS重悬，加入20μL的4×蛋白上样缓冲液混合均匀，于沸水中加热5～8min使菌体破裂并使菌体内的总蛋白变性，待样品冷却至常温后于4℃环境下12000rpm离心5min，取上清中的总蛋白小管分装保存于‑80℃，取诱导0h，1h，2h和3h时间段的处理样本进行SDS‑PAGE，电泳结束后取出凝胶进行考马斯亮蓝染色；同时以未诱导的含pET‑32a‑scFv的细菌表达蛋白为对照；(9)表达蛋白的复性与纯化：经SDS‑PAGE分析确定pET‑32a‑scFv重组质粒为包涵体表达；进行表达菌大量培养，加入终浓度为1mM的IPTG，于37℃快速振荡培养诱导重组蛋白表达3h，菌液4000rpm离心15min取菌体，按照PH0311细菌细胞总蛋白提取试剂盒说明书操作进行包涵体蛋白的提取处理后，将10mL包涵体装入截留分子量为10KD的透析袋内，将透析袋置于1000mL的复性液中，于4℃环境下作用2～4h后换新的复性液作用6～8h，再换用新的复性液作用至少2h甚至可以作用过夜；将透析袋内复性后的液体于4℃条件下13000rpm离心15min，取上清和沉淀，保留部分上清作为样本，按照Ni‑Agarose His标签蛋白纯化试剂盒说明书操作，将复性后的上清过柱纯化；(10)Western blot分析：选取纯化前后样本经过SDS‑PAGE后，转膜并孵育一抗鼠源抗His‑tag抗体、二抗兔抗鼠IgG抗体，最后的检测方法按照AEC底物显色试剂盒说明书操作制备显色液，用显色液将膜完全浸润，室温反应3～10min，用去离子水冲洗终止反应，观察结果。