[发明专利]抗IL-4R单链抗体的制备方法及其在抗肿瘤上的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗IL-4R单链抗体的制备方法及其在抗肿瘤上的应用，属于生物医学技术领域。

背景技术

肺癌是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，对人类生命和健康有着非常大威胁，是恶性肿瘤死亡的首位原因，其发病率仍呈持续上升趋势。目前，治疗肿瘤依然以手术切除肿瘤、放射疗法及化学疗法为主要手段，但是，这些疗法易造成气血亏损、免疫力低下等各种副作用且手术及放化疗手段费用昂贵，成为许多人的经济负担。因此，寻找高效低毒的中医药来治疗肿瘤已经成为国内外医药学家追寻的目标，但真正能够达到高效低毒目标的药物甚少。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种抗IL-4R单链抗体的制备方法及其在抗肿瘤上的应用，为开发利用抗IL-4R单链抗体提供依据，为进一步研制新型的抗肿瘤药物打基础。

为解决上述技术问题，本发明采用如下的技术方案：

抗IL-4R单链抗体的制备方法，包括以下步骤：

(1)动物免疫：取8只18～22g的BALB/c小鼠进行免疫，将100μg/mL的HumanIL-4R/CD124蛋白与Freund完全佐剂等体积混匀乳化进行初次免疫，腹部注射0.5mL乳剂/每只；2周后，对小鼠进行第1次加强免疫，2周后，对小鼠进行第2次加强免疫，1周后，眼眶取血和取脾脏，血液经过3500r/min离心15min，取血清，-80℃保存，脾脏用RNA保存液，-20℃保存；

(2)构建pCANTAB5E-scFv重组质粒：取40～80mg脾组织按照RNAisoPlus说明书方法操作提取总RNA；按照RevertAidFirstcDNASynthesiskit说明书方法进行cDNA第1链合成；以逆转录产物cDNA为模板，重链、轻链可变区引物序列扩增目的基因V_H和V_L；以合成的linker单链为模板，采用linker引物序列扩增目的基因；将扩增出来的V_H、V_L和linker作为模板，以scFv引物序列，通过重叠延伸PCR反应体系拼接扩增scFv；参照NotⅠ酶和SfiⅠ酶说明书分别对scFv与pCANTAB5E载体进行双酶切，参照T4连接酶说明书将双酶切过的scFv和pCANTAB5E载体进行插入连接；将pCANTAB5E-scFv重组质粒转入感受态TG1细菌，在含有200g/LMgCl₂、50mg/L氨苄青霉素、20g/L葡萄糖的SOB-AG固体培养基上37℃培养16h，取阳性重组质粒TG1单菌落进行菌落PCR鉴定，提取pCANTAB5E-scFv重组质粒，按照SfiⅠ酶和NotⅠ酶说明书操作进行双酶切鉴定；再取10个重组质粒，按照BstNⅠ内切酶说明操作进行抗体库多样性鉴定；

(3)构建抗IL-4R抗体库：：取含有pCANTAB5E-scFv重组质粒的转化菌1mL，加入含50mg/L氨苄青霉素、20g/L葡萄糖的2×YT-AG液体培养基至10mL，在37℃、250r/min振荡培养至A₆₀₀≈0.5；加入辅助噬菌体M13K07，37℃、250r/min振荡1h，1000r/min离心10min弃上清；加入10mL2×YT-AK，37℃、250r/min振荡培养16h；1000r/min离心10min，取上清移至无菌15mL的离心管中，加入2mLPEG/NaCl混合液浓缩沉淀，置于冰上60min后离心弃上清；沉淀重悬于2mL含有20mgBSA的PBS溶液，用0.45μm滤膜过滤既获得噬菌体单链抗体库；取100μL噬菌体单链抗体库溶液，用2×YT-AG液体培养基连续3次进行10倍稀释，3个稀释度各取100μL，分别加入900μL新鲜制备的E.coliTG1，室温放置15min，并分别涂布于SOB-AG固体培养基上，37℃培养16h，计算抗体滴度；