[发明专利]一种基于核酸适配体的Sandwich ELASA检测石斑鱼神经坏死病毒感染的方法

摘要

本发明公开一种基于核酸适配体的Sandwich ELASA检测石斑鱼神经坏死病毒感染的方法。将生物素标记的核酸适配体固定到预先包被了链霉亲和素的孔板上，然后用固定的适配体去捕捉待测样品中的CP蛋白，再运用生物素标记的适配体去结合CP蛋白，再加入辣根过氧化物酶‑链霉亲和素孵育结合，用辣根过氧化物酶显色试剂盒显色，根据吸光值变化分析是否有NNV病毒感染。本发明利用适配体的高亲和力、高特异性的特点，建立了基于适配体检测的夹心法ELASA检测方法，可用于石斑鱼养殖中神经坏死病毒的检测。与传统的ELISA及其他检测方法相比，本发明具有检测速度快，高灵敏度和特异性及低成本、易操作的特点。

主权项

一种基于核酸适配体的Sandwich ELASA检测石斑鱼神经坏死病毒感染的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、核酸适配体的固定：将下列任意一条石斑鱼神经坏死病毒核酸适配体加入预先包被了链霉亲和素的孔板中进行孵育结合，清洗掉过量的核酸适配体；所述的核酸适配体的序列如下序列1：5’‑GACGCTTACTCAGGTGTGACTCGTGTCATTTGTTTTGTTTGTGATTGTTTTTAATCTTAATTTTGATTGGTTCCGAAGGACGCAGATGAAGTCTC‑3’序列2：5’‑GACGCTTACTCAGGTGTGACTCGTGTGTGTCTATTGTCTGTGGTTCATGTCAAGCTTATTTTCCACACACGGTCGAAGGACGCAGATGAAGTCTC‑3’序列3：5’‑GACGCTTACTCAGGTGTGACTCGTTCTTTTATTAGTTGATTTTTTTGATTTTGGCAGCTACTGCTTTGGGGGTCGAAGGACGCAGATGAAGTCTC‑3’所述核酸适配体的5’端或3’端带有生物素标记；(2)、封闭：加入封闭液进行封闭，并清洗；(3)、靶蛋白的捕获：将感染神经坏死病毒的石斑鱼细胞样品或切碎的脑组织样品用裂解液裂解后离心，取裂解的蛋白清液加入孔板中，孵育结合使核酸适配体充分捕捉待测样品中的CP蛋白，清洗；(4)、检测：再向孔板中加入带有生物素标记的核酸适配体，孵育结合，清洗，然后加入辣根过氧化物酶‑链霉亲和素进行孵育结合，清洗；(5)、TMB显色试剂盒显色：每孔加入TMB底物显色液，室温避光反应，加入终止液终止反应，比色观察，并用酶标仪测定450nm吸光度值，根据吸光度值变化分析是否有NNV病毒感染。