[发明专利]一种基于核酸适配体的Sandwich ELASA检测石斑鱼神经坏死病毒感染的方法

说明书

技术领域：

本发明属于石斑鱼神经坏死病毒检测领域，具体涉及一种基于核酸适配体的 SandwichELASA检测石斑鱼神经坏死病毒感染的方法。

背景技术：

鱼类病毒性神经坏死病是世界范围(除非洲以外)的一种鱼类流行性传染病，给各 国海水养殖业造成了巨大的损失，为重要的鱼类病害。该病又称空泡性脑病和视网膜病，对 仔鱼和幼鱼危害很大，严重者在一周内死亡率可达100％，对成鱼也有很高的致死率。近年 来，神经坏死病毒(NNV)引起的神经坏死病在我国广泛存在，严重影响我国的水产养殖业， 尤其是石斑鱼养殖的发展。然而，关于此病的报道大多集中在NNV组织病理、分子生物学和 免疫学诊断上，如(1)根据打转，螺旋，色素异常及食欲减退的临床症状初步判断；(2)在组 织水平上的视网膜和脑的空泡化的电子显微镜观察；(3)基于细胞培养物的病毒分离；(4) 基于RT-PCR，定量RT-PCR和原位杂交的基因组分析；(5)基于抗CP抗体的酶联免疫吸附试验 (enzyme-linkedimmuno-sorbentassay,ELISA)。这些方法多存在耗时长，操作繁琐，仪器 平台要求高，稳定性差等问题。尤其不适应于石斑鱼养殖场这种没有很多分子生物学，蛋白 等仪器设备，且工作人员实验经验少的地方。急需开发出一种操作简便，快速灵敏的检测方 法用于石斑鱼养殖过程中神经坏死病毒的检测。

基于适配体在快速检测方面的优势，必须着力开发适配体在石斑鱼神经坏死病毒 (GNNV)检测中的应用。传统检测方法中，基于抗体免疫的ELISA，SandwichELISA方法是一 种比较常用的检测方法，但在实际运用中仍存在诸多不足。适配体被称为第二代抗体，核 酸适配体技术的出现弥补了抗体在相关检测领域中应用的不足：核酸适配体(Aptamer)是 通过指数富集配体系统进化技术(SystematicEvolutionofLigandsbyExponential Enrichment，SELEX)从体外人工合成的寡核苷酸文库中筛选得到的一种单链寡核苷酸序列 (RNA或DNA)，它可以形成特异性的二级结构和三级结构，通过结构互补或分子间作用力而 与靶标紧密结合；适配体可以快速的通过SELEX技术筛选获得；一旦适配体筛选出来，可以 在体外大量合成，在生产时不需要用实验动物或者细胞；适配体具有靶标特异性，即可以在 大量的分子中特异性的识别相应的靶标；适配体的靶标范围很广；适配体比较稳定，可以在 室温下稳定保存，而在高温下也可以稳定存在，而抗体则对保存条件要求较高且抗体仅在 生理条件下才有正常的功能；此外，适配体还具有低分子量，容易修饰，低毒性和无免疫原 性等优点。开发基于适配体的夹心法ELASA(enzyme-linkedapta-sorbentassay)石斑鱼 神经坏死病毒检测方法，对石斑鱼的健康防御具有重大意义，有广阔的应用前景。

发明内容：

本发明的目的是提供一种高效、快速、稳定的基于神经坏死病毒CP蛋白的高特异 性、高亲和力的核酸适配体SandwichELASA(enzyme-linkedapta-sorbentassay)检测石 斑鱼神经坏死病毒感染的方法。

本发明采用5’端修饰了生物素的石斑鱼神经坏死病毒核酸适配体，构建适配体- 靶标-适配体夹心法检测系统，并将用于检测的核酸适配体与可引发显色反应的辣根过氧 化物酶链接到一起，利用底物显色检测吸光值变化来分析样品中NNV病毒含量。其原理是： 采用生物素和链霉亲和素的紧密结合，将生物素标记的适配体固定到预先包被了链霉亲和 素的96孔板上，然后用固定的适配体去捕捉样品中的CP蛋白，再运用生物素标记的适配体 去结合CP蛋白。加入辣根过氧化物酶-链霉亲和素(HRP-streptavidin)孵育结合，用辣根 过氧化物酶显色试剂盒显色，根据吸光值变化分析是否有NNV病毒感染。

本发明的基于核酸适配体的SandwichELASA检测石斑鱼神经坏死病毒感染的方 法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、核酸适配体的固定：将下列任意一条石斑鱼神经坏死病毒核酸适配体加入预 先包被了链霉亲和素的孔板中进行孵育结合，清洗掉过量的核酸适配体；所述的核酸适配 体的序列如下：

序列1：