[发明专利]一种唾液中乙醛-DNA加合物的测定方法

摘要

一种唾液中乙醛-DNA加合物的测定方法，即唾液中Ethylidene-dG和Propano-dG的测定方法，包括采用OG-500唾液采集管收集唾液，对唾液进行DNA提取，DNA溶液进行酶水解并依次加入稳定同位素内标、还原剂NaBH₃CN和DNA水解酶。水解液经Strata-X小柱固相萃取，收集洗脱液，室温下氮吹至干，复溶于甲醇水溶液，引入LC-MS/MS系统分析，可准确检测出Et-dG和Propano-dG的含量水平。本发明采用稳定同位素作为内标定量分析物可以减少样品前处理过程中引起的误差，串联质谱法更好的提高了方法的选择性、准确性和灵敏度。通过色谱柱以及洗脱条件的选择与优化，较好的提高了色谱分离过程，缩短了色谱分析的时间，减少了有机溶剂的消耗量。

主权项

一种唾液中乙醛‑DNA加合物的测定方法，即唾液中N²‑亚乙基‑鸟嘌呤（Ethylidene‑dG）和1,N²‑丙醇‑鸟嘌呤（Propano‑dG）的测定方法，其特征在于：包括以下具体步骤：a、唾液采集：用Oragene·DNA唾液采集器（OG‑500）对人体唾液进行标准化采集；b、唾液DNA的提取：Oragene唾液混合液于50℃水浴孵育至少1h后，加入Oragene 净化液，涡旋振荡，冰浴孵育10 min；于室温下离心；移取上层清液于一新的微量离心管中，加入纯乙醇，轻轻震荡数秒；静置使DNA分子完全沉淀，离心并去上清液；加入70%的乙醇水溶液清洗DNA团块；用超纯水复溶DNA，用NanoDrop 2000超微量分光光度计在260nm处检测DNA的含量，对于双链DNA一个吸收单位（OD）相当于50 μg/mL；c、DNA的酶水解及纯化富集：将上述DNA溶于500 μL的10 mM Tris‑HCl/5 mM MgCl₂缓冲液中，加入30 mg NaBH₃CN，将N²‑亚乙基‑鸟嘌呤（Ethylidene‑dG）还原成N²‑乙基‑鸟嘌呤（Et‑dG）来检测；加入20 μL混合内标，加入30U脱氧核糖核酸酶Ⅰ，在37℃中孵育2h，随后加入0.008U磷酸二酯酶Ⅰ和15U碱性磷酸酶在37℃中继续孵育2h；水解液经Strata‑X固相萃取，收集洗脱液液氮吹至干，复溶于100 μL 30%甲醇水溶液，即为样品待测液；d、标准工作液的配制：用甲醇配制不同浓度的N²‑亚乙基‑鸟嘌呤（Ethylidene‑dG）、1,N²‑丙醇‑鸟嘌呤（Propano‑dG）标准工作溶液；e、液相色谱‑串联质谱（LC‑MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度混合标准工作溶液，注入LC‑MS/MS系统，得到线性回归方程，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量。