[发明专利]一种唾液中乙醛-DNA加合物的测定方法在审
申请号: | 201610226320.8 | 申请日: | 2016-04-13 |
公开(公告)号: | CN105628847A | 公开(公告)日: | 2016-06-01 |
发明(设计)人: | 胡清源;陈欢;侯宏卫;刘鲁娟;张小涛;朱欣潮;张森 | 申请(专利权)人: | 国家烟草质量监督检验中心 |
主分类号: | G01N30/88 | 分类号: | G01N30/88 |
代理公司: | 郑州中民专利代理有限公司 41110 | 代理人: | 姜振东 |
地址: | 450001 *** | 国省代码: | 河南;41 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 唾液 乙醛 dna 加合物 测定 方法 | ||
1.一种唾液中乙醛-DNA加合物的测定方法,即唾液中N2-亚乙基-鸟嘌呤(Ethylidene- dG)和1,N2-丙醇-鸟嘌呤(Propano-dG)的测定方法,其特征在于:包括以下具体步骤:
a、唾液采集:用Oragene·DNA唾液采集器(OG-500)对人体唾液进行标准化采集;
b、唾液DNA的提取:Oragene唾液混合液于50℃水浴孵育至少1h后,加入Oragene净化 液,涡旋振荡,冰浴孵育10min;于室温下离心;移取上层清液于一新的微量离心管中,加入 纯乙醇,轻轻震荡数秒;静置使DNA分子完全沉淀,离心并去上清液;加入70%的乙醇水溶液 清洗DNA团块;用超纯水复溶DNA,用NanoDrop2000超微量分光光度计在260nm处检测DNA的 含量,对于双链DNA一个吸收单位(OD)相当于50μg/mL;
c、DNA的酶水解及纯化富集:将上述DNA溶于500μL的10mMTris-HCl/5mMMgCl2缓冲 液中,加入30mgNaBH3CN,将N2-亚乙基-鸟嘌呤(Ethylidene-dG)还原成N2-乙基-鸟嘌呤 (Et-dG)来检测;加入20μL混合内标,加入30U脱氧核糖核酸酶Ⅰ,在37℃中孵育2h,随后加 入0.008U磷酸二酯酶Ⅰ和15U碱性磷酸酶在37℃中继续孵育2h;水解液经Strata-X固相萃 取,收集洗脱液液氮吹至干,复溶于100μL30%甲醇水溶液,即为样品待测液;
d、标准工作液的配制:用甲醇配制不同浓度的N2-亚乙基-鸟嘌呤(Ethylidene-dG)、1, N2-丙醇-鸟嘌呤(Propano-dG)标准工作溶液;
e、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定,吸取配制好的不同浓度混合标准工作溶液,注 入LC-MS/MS系统,得到线性回归方程,对样品待测液进行测定,测得分析物与内标峰面积的 比值,代入一元线性回归方程,求得样品待测液中分析物的含量。
2.根据权利要求1所述的唾液中乙醛-DNA加合物的测定方法,其特征在于:步骤c中所 述的混合内标为10ng/mL的[15N5]Et-dG和[15N5]Propano-dG。
3.根据权利要求1所述的唾液中乙醛-DNA加合物的测定方法,其特征在于:步骤e中选 取了ThermoAcdivTMPolarAdvantageIIC18色谱柱,规格4.6×150mm,3μm,流动相 体系选取A:0.01%甲酸甲醇,B:10mM乙酸铵水溶液,梯度洗脱,分析时间为25min,进样量 为5μL。
4.根据权利要求3所述的唾液中乙醛-DNA加合物的测定方法,其特征在于:梯度洗脱程 序:0-2min:25%A,2-17min:35%A,17-25min:25%A;流速为0.38mL/min;流速为0.38 mL/min。
5.根据权利要求1所述的唾液中乙醛-DNA加合物的测定方法,其特征在于:步骤e中串 联质谱检测器的条件:电喷雾离子源ESI,多反应监测正离子扫描方式;喷雾电压:5500V, 离子源温度:550℃,气帘气的量为20psi,雾化气为70psi,干燥气为75psi,碰撞气为9 psi,射入电压:10V,碰撞能:9eV,驻留时间:100ms;监测离子对为Et-dG:296.2→180.2 定量离子对,296.2→117.2定性离子对;内标[15N5]Et-dG为271.2→155.2;Propano-dG: 338.3→222.1定量离子对,338.3→117.2定性离子对;内标[15N5]Propano-dG为343.2→ 227.2。
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