[发明专利]一种从动物血块提取、纯化SOD冻干粉的生产方法

摘要

本发明的目的是提供一种从动物血块提取、纯化SOD冻干粉的生产方法，是将动物血块经破碎后，经过乳化、溶血、沉淀、压滤、超滤、热变性、柱色谱、修饰、丙酮沉淀、冻干等工序，最后得到修饰SOD冻干粉产品。本发明采用的原料上使用凝固血块，而不用加抗凝剂的红血球，一般的提取是先按比例添加一定的抗凝剂而收集未凝固血液，再离心收集红血球，用生理盐水反复离心洗涤红血球，这样费时费力，离心负荷很大，且抗凝剂的比例掌握不好会发生凝血或溶血；而本发明是在收集血液时不加抗凝剂，也不用反复离心收集、洗涤红血球，直接用自然凝固的血块做原料，这样省时省力，也不用离心，适于规模化生产。本发明在沉淀血红蛋白时不用易挥发的乙醇，也不用有毒害的氯仿，而用无机盐，不仅沉淀效果好，又减少了环境污染和对生产人员的身体伤害。

主权项

1.一种从动物血块提取、纯化SOD冻干粉的生产方法，是将动物血块经破碎、乳化、溶血、沉淀、压滤、超滤、热变性、柱色谱、修饰、丙酮沉淀、冻干，得到修饰SOD冻干粉，其步骤如下：1）、收集牦牛、黄牛、猪、或羊多种动物在屠宰时的血液，自然凝固后滤去血清得到的新鲜血块，或新鲜血块冷冻储藏后的冷冻血块；2）、用破碎机将大血块破碎成小血块；3）、将破碎后的小血块倒入乳化机中，乳化15～40分钟；4）、将乳化后的血液，泵入到1.2～2.0倍血液体积的二级反渗透水中，搅拌30～60分钟，使红血球破膜而溶血，得溶血液；5）、在常温下，向溶血液中同时加入两种无机盐，使血红蛋白沉淀下来，SOD溶解在悬浊液中；所述的一种无机盐是氯化钠，重量占溶血液体积的1.5～5.0%；另一种无机盐是氯化铜或硫酸铜，重量占溶血液体积的0.6～1.5%；6）、将步骤5的悬浊液泵入到压滤缸中，加压过滤得到SOD压滤液；7）、将SOD压滤液泵入到截留分子量为3000～10000D的中空纤维超滤器中，超滤浓缩，得到SOD浓缩液；8）、将SOD浓缩液于55～65℃水浴中加热10～30分钟，冷却后离心，去除杂蛋白沉淀，收集SOD热变液；9）、将SOD热变液上样到预先用平衡液平衡的Sepharose Fast Flow色谱柱中，再用平衡液平衡6～15小时，至柱流出液A280值为0.1以下；再用洗脱液洗脱，收集蓝绿色SOD色谱带的下柱液；所述的平衡液为pH 7.8的2.5 mmol/L的Tris‑HCl缓冲液；所述的洗脱液为含0.1mol/L NaCl的pH 7.8的2.5 mmol/L的Tris‑HCl缓冲液；10）、把SOD下柱液置于48～55℃的水浴中，用碱溶液调pH值至9.0～9.5，缓慢加入蛋白质修饰剂，反应1.2～1.5小时，冷却后离心，得到修饰SOD液；所述的碱溶液是1 ～4mol/L的氢氧化钠溶液，或1 ～4 mol/L的氢氧化钾溶液；所述的蛋白质修饰剂是肉豆蔻酰氯；11）、在修饰SOD液中加入1.4～2.0倍体积的冷丙酮，搅拌放置后SOD沉淀下来，再离心收集SOD沉淀；12）、将SOD沉淀放置于冻干机中，进行真空冷冻干燥，得到修饰SOD冻干粉。