[发明专利]CRISPR-Cas9系统介导的羊MSTN基因敲除和定点整合外源基因的方法有效
| 申请号： | 201610123332.8 | 申请日： | 2016-03-04 |
| 公开（公告）号： | CN105671080B | 公开（公告）日： | 2020-01-31 |
| 发明（设计）人： | 仓明;张驹;梁浩;聂永伟;梁宏宇;崔梦兰;刘东军 | 申请（专利权）人： | 内蒙古大学 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N5/10;A01K67/027 |
| 代理公司： | 11002 北京路浩知识产权代理有限公司 | 代理人： | 王文君 |
| 地址： | 010021 内蒙古自治区呼*** | 国省代码： | 内蒙;15 |
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| 摘要： | 本发明涉及CRISPR‑Cas9系统介导的羊MSTN基因敲除和定点整合外源基因的方法，其是根据羊的MSTN基因序列，构建基于CRISPR‑Cas9系统的gRNA表达载体，并根据gRNA作用位点构建含有外源基因的且可以整合至宿主基因组中的供体质粒，然后将优化的CRISPR‑Cas9载体、上述构建的gRNA表达载体和线性化的供体质粒共同转入羊的成纤维细胞中，获得羊MSTN基因敲除且定点整合外源基因的细胞。本发明构建的CRISPR‑Cas9介导的打靶载体为羊MSTN基因的敲除和外源基因的定点整合提供了一种简便快速安全的途径，大大提高了转基因细胞系的筛选效率。该方法实现了不添加任何筛选标记即可筛选定点整合外源基因细胞系，大大提高了转基因动物的安全性，对羊的遗传育种具有重要价值。 | ||
| 搜索关键词： | crisper cas9 系统 mstn 基因 定点 整合 方法 | ||
【主权项】：
1.CRISPR-Cas9系统介导的羊MSTN基因敲除和定点整合外源基因的方法，其特征在于，其是根据羊的MSTN基因序列，构建基于CRISPR-Cas9系统的gRNA表达载体，并根据gRNA作用位点构建含有外源基因的且可以整合至宿主基因组中的供体质粒，然后将优化的CRISPR-Cas9载体、上述构建的gRNA表达载体和线性化的供体质粒共同转入阿尔巴斯绒山羊胎儿成纤维细胞中，获得羊MSTN基因敲除且定点整合外源基因的细胞；/ngRNA作用位点的DNA序列为5′-CGTTACGACGGAAACGGTCA-3′；/n所述优化的CRISPR-Cas9载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述gRNA表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述供体质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；/n用于鉴定羊MSTN基因敲除且定点整合外源基因的细胞的引物如下：/nJC-KI-F TACCAGCACAGTAGTGAGAAGC/nJC-KI-R GGGCTATGAACTAATGACCCCG。/n
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