[发明专利]CRISPR-Cas9系统介导的羊MSTN基因敲除和定点整合外源基因的方法

权利要求书

1.CRISPR-Cas9系统介导的羊MSTN基因敲除和定点整合外源基因的方法，其特征在于，其是根据羊的MSTN基因序列，构建基于CRISPR-Cas9系统的gRNA表达载体，并根据gRNA作用位点构建含有外源基因的且可以整合至宿主基因组中的供体质粒，然后将优化的CRISPR-Cas9载体、上述构建的gRNA表达载体和线性化的供体质粒共同转入阿尔巴斯绒山羊胎儿成纤维细胞中，获得羊MSTN基因敲除且定点整合外源基因的细胞；

gRNA作用位点的DNA序列为5′-CGTTACGACGGAAACGGTCA-3′；

所述优化的CRISPR-Cas9载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述gRNA表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述供体质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

用于鉴定羊MSTN基因敲除且定点整合外源基因的细胞的引物如下：

JC-KI-F TACCAGCACAGTAGTGAGAAGC

JC-KI-R GGGCTATGAACTAATGACCCCG。

2.根据权利要求1所述方法获得的羊MSTN基因敲除且定点整合外源基因的细胞。

3.权利要求1所述方法在生产羊MSTN基因敲除且定点整合外源基因的克隆羊中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，以权利要求2所述羊MSTN基因敲除且定点整合外源基因的细胞为核移植供体细胞，离体的羊卵母细胞为核移植受体细胞，通过核移植技术获得羊克隆胚胎，然后将克隆胚胎通过非手术法移入羊子宫内进行妊娠，获得转基因羊。