[发明专利]一种水体中微生物DNA的提取方法

摘要

一种水体中微生物DNA的提取方法，采用无菌微孔滤膜收集微生物，利用物理和化学方法破碎微生物细胞，其次采用醋酸钾、异硫氰酸胍、柠檬酸钠等试剂去除腐殖酸等杂质，将细胞裂解液进行多次离心纯化，最后用乙醇和醋酸钾抽提后得到纯化的微生物基因组DNA，所提取的微生物DNA具有较好的完整性，纯度高，产量高，其OD260/OD280比值在1.8～2.0之间，经琼脂糖凝胶电泳后染色，DNA条带清晰且单一，无拖尾，无杂带，获得的微生物DNA产量高、操作简单、成本低，提取过程无需再纯化，缩减了提取步骤，降底了提取成本，适用于各种水体微生物的多样性分析。

主权项

一种水体中微生物DNA的提取方法，包括如下步骤：1)收集微生物将水样经微孔滤膜过滤，收集滤膜，在无菌条件下，将滤膜剪碎，放入离心管；2)破碎微生物细胞向步骤1)的离心管中加入氧化锆、试剂I、试剂II，震荡，离心，取上清液；其中，所述的试剂I为0.2～0.3M磷酸缓冲液，pH＝7.0～8.0；所述的试剂II包括：1～2wt.％SDS细胞裂解液，20～60mM Tris‑HCl，100～200mM NaCl，40～100mM EDTA，0.1～1wt.％乙烯聚吡咯烷酮，pH＝7.8～8.0；3)去除腐殖酸和蛋白质向步骤2)的上清液中加入试剂III，混匀，离心，向离心后的上清液中加入试剂IV，混匀，离心，得到裂解液；其中，所述的试剂III为80～120mM硫酸铝；所述的试剂IV中含有浓度为2～5M的醋酸钾、2～6wt.％的冰醋酸，pH＝4.6～5.0；4)纯化裂解液将裂解液的上清液中加入试剂V，混匀，移入核酸纯化柱中，静置，离心，弃去虑液；向核酸纯化柱中加入试剂VI纯化，离心，弃去滤液，再加试剂VII纯化，离心，弃去滤液；其中，利用试剂VII纯化2～3次；其中，所述的试剂V中含有：6～10M异硫氰酸胍，0.2～0.6M醋酸钾；所述的试剂VI中含有：6～10M异硫氰酸胍，20～23mM柠檬酸钠；所述的试剂VII中含有：70～75％乙醇，体积分数；5)洗脱DNA将核酸纯化柱安置于离心管内，离心，向核酸纯化柱中加入灭菌蒸馏水，室温静置，将静置后获得的洗脱液进行离心，获得所述微生物DNA。