[发明专利]一种水体中微生物DNA的提取方法

权利要求书

1.一种水体中微生物DNA的提取方法，包括如下步骤：

1)收集微生物

将水样经微孔滤膜过滤，收集滤膜，在无菌条件下，将滤膜剪碎，放入离心管；

2)破碎微生物细胞

向步骤1)的离心管中加入氧化锆、试剂I、试剂II，震荡，离心，取上清液；

其中，所述的试剂I为0.2～0.3M磷酸缓冲液，pH＝7.0～8.0；所述的试剂II包括：1～2wt.％SDS细胞裂解液，20～60mM Tris-HCl，100～200mM NaCl，40～100mM EDTA，0.1～1wt.％乙烯聚吡咯烷酮，pH＝7.8～8.0；

3)去除腐殖酸和蛋白质

向步骤2)的上清液中加入试剂III，混匀，离心，向离心后的上清液中加入试剂IV，混匀，离心，得到裂解液；

其中，所述的试剂III为80～120mM硫酸铝；所述的试剂IV中含有浓度为2～5M的醋酸钾、2～6wt.％的冰醋酸，pH＝4.6～5.0；

4)纯化裂解液

将裂解液的上清液中加入试剂V，混匀，移入核酸纯化柱中，静置，离心，弃去虑液；向核酸纯化柱中加入试剂VI纯化，离心，弃去滤液，再加试剂VII纯化，离心，弃去滤液；其中，利用试剂VII纯化2～3次；

其中，所述的试剂V中含有：6～10M异硫氰酸胍，0.2～0.6M醋酸钾；所述的试剂VI中含有：6～10M异硫氰酸胍，20～23mM柠檬酸钠；所述的试剂VII中含有：70～75％乙醇，体积分数；

5)洗脱DNA

将核酸纯化柱安置于离心管内，离心，向核酸纯化柱中加入灭菌蒸馏水，室温静置，将静置后获得的洗脱液进行离心，获得所述微生物DNA。

2.根据权利要求1所述的水体中微生物DNA的提取方法，其特征在于，步骤2)中所述氧化锆粒径为：1.0～1.2mm。

3.根据权利要求1所述的水体中微生物DNA的提取方法，其特征在于，所述试剂II中包括：1.4～1.6wt.％SDS细胞裂解液，30～50mM Tris-HCl，140～160mM NaCl，60～80mM EDTA，0.4～0.6wt.％乙烯聚吡咯烷酮，PH＝7.85～7.95。

4.根据权利要求1所述的水体中微生物DNA的提取方法，其特征在于，步骤4)所述的核酸纯化柱是含有聚丙烯膜+硅胶膜的核酸纯化柱。

5.根据权利要求1所述的水体中微生物DNA的提取方法，其特征在于，所述试剂III为90～110mM硫酸铝。

6.根据权利要求1所述的水体中微生物DNA的提取方法，其特征在于，所述试剂IV包括：3～4M的醋酸钾、3～5wt.％的冰醋酸，PH＝4.7～4.9。

7.根据权利要求1所述的水体中微生物DNA的提取方法，其特征在于，步骤5)中洗脱DNA时，灭菌蒸馏水加热至60～65℃。

8.根据权利要求1所述的水体中微生物DNA的提取方法，其特征在于，还包括将获得的微生物DNA保存于-20～-18℃。

9.根据权利要求1-8任一项所述的水体中微生物的提取方法，其特征在于，所述水样的体积为50～100ml，所述的氧化锆的加入量为0.8～1.0g，水样和试剂I的体积比为40～50:1。

10.根据权利要求9所述的水体中微生物的提取方法，其特征在于，所述的试剂I、试剂II、试剂III、试剂IV、试剂V、试剂VI和试剂VII之间的体积比为1：0.15～0.2：0.15～0.2：0.3～0.4：1～1.2：0.4～0.6：0.4～0.6。