[发明专利]一种暗褐网柄牛肝菌菌种衰退的判定方法

摘要

本发明公开了一种暗褐网柄牛肝菌菌种衰退的判定方法，通过观察菌落形态、测定生长速率、测定菌落淀粉酶分泌能力、可溶性蛋白分析、酯酶同工酶分析等步骤，对暗褐网柄牛肝菌菌种活性作出预判，找到可以表征暗褐网柄牛肝菌菌种随继代次数增多发生衰退的生理生化特征，为菌种活力鉴定提供了快速有效的判定方法，该方法为暗褐网柄牛肝菌的菌种衰退提供了有效的判定依据，大大降低了误用衰退菌株的风险，有利于暗褐网柄牛肝菌栽培技术的推广。

主权项

1.暗褐网柄牛肝菌菌种活性衰退的判定方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）观察菌落形态、测定生长速率：菌株30℃避光培养，分别于至少5个不同时间点十字交叉法测量菌落半径，计算平均菌落生长速率；同时于菌丝体长满培养皿时观察菌落形态特征；与菌株第一代原种相比，菌落吐水少，菌核小，平均菌落生长速率变化率≥10%；所述平均菌落生长速率变化率=（｜菌株平均菌落生长速率－第一代原种平均菌落生长速率｜）/第一代原种平均菌落生长速率×100%；所述平均菌落生长速率为：以不同时间点为横坐标，不同时间点对应的平均菌落半径为纵坐标，获取的直线斜率即为菌株平均菌落生长速率；（2）测定菌落淀粉酶分泌能力：菌株培养15天后用刚果红法或卢戈氏碘液法获得淀粉变色圈，然后采用十字交叉法测定平均菌落直径和平均变色圈直径，并与菌株第一代原种对应结果数据进行比较，采用刚果红法测定变色圈直径/菌落直径的比值降低幅度≥10%，采用卢戈氏碘液法测定变色圈直径/菌落直径的比值降低幅度≥5%；（3）可溶性蛋白分析：菌株150 rpm、30℃避光振荡培养7天，过滤，滤渣清洗，除水，液氮研磨至粉碎，取粉碎物用pH为7.2 的磷酸盐缓冲液混匀，12000 rpm离心10min，吸取上清液即为可溶性蛋白样品，采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行可溶性蛋白分析，与菌株第一代原种相比，相对分子量为40.0kDa的可溶性蛋白条带变弱，而相对分子量为22.0 kDa的可溶性蛋白条带增强；（4）酯酶同工酶分析：菌株150 rpm、30℃避光振荡培养7天，过滤，滤渣清洗，除水，液氮研磨至粉碎，取粉碎物用pH为5.6的磷酸盐缓冲液混匀，12000 rpm离心10min，吸取上清液即为酯酶同工酶样品，使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行酯酶同工酶分析，与菌株第一代原种相比，相对分子量为37.0 kDa的酯酶同工酶活性增强。