[发明专利]一种暗褐网柄牛肝菌菌种衰退的判定方法

权利要求书

1.暗褐网柄牛肝菌菌种活性衰退的判定方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）观察菌落形态、测定生长速率：菌株30℃避光培养，分别于至少5个不同时间点十字交叉法测量菌落半径，计算平均菌落生长速率；同时于菌丝体长满培养皿时观察菌落形态特征；与菌株第一代原种相比，菌落吐水少，菌核小，平均菌落生长速率变化率≥10%；

所述平均菌落生长速率变化率=（｜菌株平均菌落生长速率－第一代原种平均菌落生长速率｜）/第一代原种平均菌落生长速率×100%；

所述平均菌落生长速率为：以不同时间点为横坐标，不同时间点对应的平均菌落半径为纵坐标，获取的直线斜率即为菌株平均菌落生长速率；

（2）测定菌落淀粉酶分泌能力：菌株培养15天后用刚果红法或卢戈氏碘液法获得淀粉变色圈，然后采用十字交叉法测定平均菌落直径和平均变色圈直径，并与菌株第一代原种对应结果数据进行比较，采用刚果红法测定变色圈直径/菌落直径的比值降低幅度≥10%，采用卢戈氏碘液法测定变色圈直径/菌落直径的比值降低幅度≥5%；

（3）可溶性蛋白分析：菌株150 rpm、30℃避光振荡培养7天，过滤，滤渣清洗，除水，液氮研磨至粉碎，取粉碎物用pH为7.2 的磷酸盐缓冲液混匀，12000 rpm离心10min，吸取上清液即为可溶性蛋白样品，采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行可溶性蛋白分析，与菌株第一代原种相比，相对分子量为40.0kDa的可溶性蛋白条带变弱，而相对分子量为22.0 kDa的可溶性蛋白条带增强；

（4）酯酶同工酶分析：菌株150 rpm、30℃避光振荡培养7天，过滤，滤渣清洗，除水，液氮研磨至粉碎，取粉碎物用pH为5.6的磷酸盐缓冲液混匀，12000 rpm离心10min，吸取上清液即为酯酶同工酶样品，使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行酯酶同工酶分析，与菌株第一代原种相比，相对分子量为37.0 kDa的酯酶同工酶活性增强。

2.根据权利要求1所述的暗褐网柄牛肝菌菌种活性衰退的判定方法，其特征在于，步骤（1）所用培养基为M1固体培养基，（3）和（4）中所用培养基为M1液体培养基。

3.根据权利要求2所述的暗褐网柄牛肝菌菌种活性衰退的判定方法，其特征在于，按重量份计，所述M1液体培养基的成分组成为：

去皮马铃薯200.0份，葡萄糖20.0份，酵母膏2.0份，MgSO₄·7H₂O 1.0 份，KH₂ PO₄ 1.0份，水1000.0 份；M1固体培养基另加15.0份琼脂粉。

4.根据权利要求2所述的暗褐网柄牛肝菌菌种活性衰退的判定方法，其特征在于，步骤（2）中卢戈氏碘液法测定淀粉变色圈直径使用的菌种培养基为M1淀粉固体培养基，按重量份计，所述M1淀粉固体培养基的成分组成为：

去皮马铃薯200.0份，葡萄糖10.0份，酵母膏2.0份，MgSO₄·7H₂O 1.0 份，KH₂ PO₄ 1.0份，水1000.0 份，可溶性淀粉2.0份，琼脂粉15.0份；

刚果红法测定淀粉变色圈直径使用的菌种培养基为M1淀粉固体培养基另加2份刚果红。

5.根据权利要求1所述的暗褐网柄牛肝菌菌种活性衰退的判定方法，其特征在于，菌株在培养前先进行菌种活化，所述菌种活化条件为将菌株在M1固体培养基上活化，30℃避光培养20天。

6.根据权利要求1所述的暗褐网柄牛肝菌菌种活性衰退的判定方法，其特征在于，步骤（3）中变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶中丙烯酰胺质量体积浓度为5%，分离胶中丙烯酰胺质量体积浓度为10%，SDS质量体积浓度为0.1%，电泳电压为浓缩胶80V、分离胶150V。

7.根据权利要求1所述的暗褐网柄牛肝菌菌种活性衰退的判定方法，其特征在于，步骤（4）中非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶中丙烯酰胺质量体积浓度为5%，分离胶中丙烯酰胺质量体积浓度为8%，电泳电压为浓缩胶80V，分离胶150V。

8.根据权利要求1所述的暗褐网柄牛肝菌菌种活性衰退的判定方法，其特征在于，所述步骤（1）中测量菌落半径的时间点分别在菌株培养的第3、6、9、12、15和18 天。