[发明专利]基于微粒子化学发光免疫分析的人血清脂联素检测试剂盒

摘要

基于微粒子化学发光免疫分析的人血清脂联素检测试剂盒，涉及化学发光检测试剂盒。所述人血清脂联素检测试剂盒包括反应缓冲液、包被有脂联素单克隆抗体的磁性微粒子、标记有吖啶酯的脂联素单克隆抗体、发光液A、发光液B、脂联素抗原标准品溶液、浓缩洗涤液。制备方法：制备反应缓冲液；制备包被有脂联素抗体的磁微粒；制备吖啶酯标记的脂联素抗体；制备脂联素抗原标准品溶液；制备发光液；制备洗涤液。采用磁性微粒子偶联单克隆抗体，由于微粒子可以悬浮于样本溶液中，有利于微粒子表面抗体与待测物充分接触，缩短反应时间；以吖啶酯作为标记物，可得到稳定、高强度的信号。操作简单、灵敏度高、线性范围宽、结果稳定、安全性好、便于自动化。

主权项

1.基于微粒子化学发光免疫分析的人血清脂联素检测试剂盒，其特征在于，其由反应缓冲液、包被有脂联素单克隆抗体的磁性微粒子、标记有吖啶酯的脂联素单克隆抗体、发光液A、发光液B、脂联素抗原标准品溶液、浓缩洗涤液组成；所述反应缓冲液为pH为7.4的磷酸盐缓冲液，内含1％牛血清白蛋白、0.5％酪蛋白、0.1％Triton X‑100、防腐剂；所述磁性微粒子为表面覆有亲水性聚合物和羧基的磁珠，所述磁性微粒子的粒径为1.5～3μm；所述基于微粒子化学发光免疫分析的人血清脂联素检测试剂盒是由包括以下步骤的制备方法制备的：1)制备反应缓冲液：所述反应缓冲液为pH为7.4的磷酸盐缓冲液，内含1％牛血清白蛋白、0.5％酪蛋白、0.1％Triton X‑100和防腐剂；2)制备包被有脂联素抗体的磁微粒：在磁微粒、EDC与NHS中加入MES溶液，再放置在垂直旋转仪上活化，将活化后的磁微粒与脂联素单克隆抗体放置在垂直旋转仪上标记，将反应后的磁微粒洗涤，再加入含有甘氨酸、0.5％牛血清白蛋白、0.05％Triton X‑100、pH为7.4的磷酸盐缓冲液，然后放置在垂直旋转仪上终止，将终止后的磁微粒洗涤，加入含有1％牛血清白蛋白、0.5％酪蛋白、0.1％Triton X‑100、防腐剂、pH为7.4的磷酸盐缓冲液，得包被有脂联素单克隆抗体的磁微粒，其中，所述磁微粒、EDC与NHS的质量比为1∶1∶1；所述MES溶液为pH为5的50mM MES溶液，使磁微粒的质量浓度为4mg/ml；所述活化的温度为25℃，活化的时间为20min；所述活化后的磁微粒与脂联素单克隆抗体的质量比为1000∶15；所述标记的温度为25℃，标记的时间为3h；所述洗涤为洗涤3次；所述加入含有甘氨酸、0.5％牛血清白蛋白、0.05％Triton X‑100、pH为7.4的磷酸盐缓冲液后，使磁微粒浓度为4mg/ml；所述放置在垂直旋转仪上终止的反应环境温度为25℃，时间为2h；所述加入含有1％牛血清白蛋白、0.5％酪蛋白、0.1％Triton X‑100、防腐剂、pH为7.4的磷酸盐缓冲液后，使磁微粒浓度为4mg/ml；3)制备吖啶酯标记的脂联素抗体：取待标记脂联素单克隆抗体50μg，加入含Nacl的磷酸盐缓冲液至体积为300μl，再加入5μl吖啶酯母液，振荡混匀，反应30min后加入200μl含Nacl和甘氨酸的磷酸盐缓冲液，混匀，反应30min后将产物转移至透析袋中，透析液为pH为7.4的20mM PBS缓冲液，2～8℃避光透析，每隔2h换一次PBS缓冲液，共更换3次，以除去未标记的吖啶酯；将标记物取出，按实际体积加入10％牛血清白蛋白至牛血清白蛋白的终浓度为0.1％，体积比为1∶100，加入等体积甘油，混匀后，‑15℃以下避光保存备用，其中，所述混匀采用手工颠倒20次混匀；4)制备脂联素抗原标准品溶液：采用脂联素抗原，再用含有1％牛血清白蛋白、0.5％酪蛋白、0.1％Triton X‑100、防腐剂、PH为7.4的磷酸盐缓冲液梯度稀释为240000ng/ml、160000ng/ml、106666.67ng/ml、71111.11ng/ml、47407.41ng/ml、23703.7ng/ml、11851.85ng/ml、5925.926ng/ml、2962.963ng/ml、1481.481ng/ml、740.7407ng/ml、370.3704ng/ml、185.1852ng/ml、92.59259ng/ml、46.2963ng/ml的系列脂联素抗原标准品溶液；5)制备发光液：发光液包括A液和B液，所述A液为过氧化氢和硝酸水溶液，A液中过氧化氢的质量浓度为0.5％～3％，硝酸的摩尔浓度为0.01～0.5M；所述B液为氢氧化钠与Triton X‑100水溶液，氢氧化钠的摩尔浓度为0.05～1M，Triton X‑100的体积浓度为0.1％～2％；6)制备洗涤液：洗涤液是含有表面活性剂和生物防腐剂的磷酸盐缓冲液，其中，所述表面活性剂采用Triton X‑100表面活性剂，所述生物防腐剂采用Proclin防腐剂；而且，所述人血清脂联素检测试剂盒对人血清脂联素的检测过程如下：取10μl血清、100μl反应缓冲液以及用反应缓冲液稀释为0.4mg/ml的50μl磁微粒在37℃的条件下反应15min，然后用洗涤液洗涤2次，再加入50μl吖啶酯标记的抗体，37℃反应10min，再用洗涤液洗涤4次，最终加入发光液A和发光液B，测定发光值。