[发明专利]应用Sso7d-IN融合蛋白进行HIV-1整合酶3′加工抑制剂筛选的方法

摘要

应用Sso7d-IN融合蛋白进行HIV-1整合酶3′加工抑制剂筛选的方法，属于生物技术领域。Sso7d是一小段硫磺矿硫化叶菌DNA蛋白。Sso7d与整合酶(IN)融合表达提高IN的溶解性和活性，在纯化过程中无需使用高盐及pH值较高的缓冲液，可以更有效的催化整合体的形成以及与寡核苷酸DNA底物整合的相关过程，与IN相比，3′加工反应活性提高了5倍左右，并在抑制剂筛选过程中提高阳性与阴性值之间的差异。

主权项

一种应用Sso7d‑IN融合蛋白进行HIV‑1整合酶3′加工抑制剂筛选的方法，包括以下步骤：(1)HIV‑1Sso7d‑IN整合酶重组蛋白的制备将合成的Sso7d基因片段与野生型整合酶(integrase,IN)基因分别扩增，通过融合PCR连接，构建Sso7d‑IN表达载体，表达并纯化HIV‑1Sso7d‑IN整合酶重组蛋白，分装保存待用；室温下将待测化合物样品用二甲基亚砜(DMSO)配制成不同浓度的溶液，充分振荡溶解后备用；(2)DNA底物的制备用退火缓冲液溶解DNA底物后，PCR仪设定程序94℃2min，每90s下降1℃，约2h后，底物会自发形成互补双链；上述退火缓冲液含有10mM Tris，50mM NaCl，1mM EDTA，pH＝8.0；DNA底物为5′‑(FAM)‑ACT GCT AGA GAT TTT CCA CGT GGA AAA TCT CTA GCA GT‑3′‑(DABCYL)；(3)待测化合物样品的筛选反应在96孔不透明微孔板中进行，阳性对照组2孔，每孔分别加2μL DMSO，阴性对照组2孔，每孔分别加2μL DMSO，其他孔的实验组中加入2μL不同浓度的待测化合物样品；除阴性对照组，其余都加Sso7d‑IN；具体操作如下：a、反应体系总体积为100μL，用ddH₂O洗板一次，然后每孔加入2×反应缓冲液50μL，加入DTT 2μL，2.5μg纯化的Sso7d‑IN整合酶重组蛋白；b、然后阳性对照组的孔和阴性对照组的孔分别2μL DMSO，实验组的其他孔加入2μL用DMSO稀释的待测化合物；然后ddH₂O补足体积；c、与HIV‑1Sso7d‑IN整合酶重组蛋白在无MnCl₂的反应缓冲液中37℃孵育30min后，每孔加入终浓度为10mmol/L的Mn²⁺、20pmol DNA底物，混匀；37℃反应2h，用酶标仪读取荧光读值；d、同样设置了待测化合物与DNA底物组，只加2×反应缓冲液50μL、20pmol DNA底物、2μL用DMSO稀释的待测化合物，37℃孵育2h后用酶标仪读取荧光读值；选择激发光波长为485nm，发射光波长为528nm；上述2×反应缓冲液含有40mM HEPES、200mM NaCl、50％(g/L)甘油，pH＝7.6；(4)按照以下公式计算待测样品的抑制率：通过测定不同浓度下的待测化合物样品抑制率可得出待测化合物的IC₅₀值。