[发明专利]应用Sso7d-IN融合蛋白进行HIV-1整合酶3′加工抑制剂筛选的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说是将一种新构建的HIV-1整合酶应用于3′加 工抑制剂体外筛选方法。

背景技术

Sso7d有助于稳定DNA双螺旋结构并促使DNA构型转变，Sso7d与IN基因连接，构建 出的Sso7d-IN有较好的溶解性和活性。与野生型整合酶不同的是，它可以更有效的催化整 合体的形成以及与寡核苷酸DNA底物的相关整合过程，并将其应用于对整合酶3′加工抑制 剂的体外筛选。

目前应用于整合酶3′加工抑制剂常用筛选的方法有：

1.分子信标方法

此方法是根据荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer， FRET)设计出的一段具有茎环结构的寡核苷酸链，两端分别偶联荧光基团和淬灭基团。He根 据此原理，设计了38nt的单链DNA底物，退火形成与HIV-1LTRU5相同的序列，在该链的5′端 和3′端分别用荧光基团FAM和淬灭基团DABCYL修饰标记。无IN蛋白存在时，FAM和DABCYL空 间距离近时，FAM受激发后发射的荧光被DABCYL吸收淬灭，检测不到荧光信号；加入IN后，整 合酶特异性识别3′末端的CAGT序列，切下连有DABCYL的GT二核苷酸，FAM与DABCYL的距离变 大，FAM受激发后发射的荧光不再受DABCYL淬灭，激发发射能检测到荧光信号。如抑制剂的 抑制效果好，荧光强度降低。本发明在此方法基础上，进行改进，不同的是应用Sso7d-IN代 替IN，提高反应过程中阳性与阴性值间的差异，有利于抑制剂的筛选。(何红秋.HIV-1整合 酶活性检测方法建立和应用研究.北京工业大学博士论文.2010)。

2.酶联免疫吸附法

此方法利用时间分辨荧光(timeresolvedfluoroimmunoassay，TRFIA)分析法筛 选，该方法的原理是：在合成的一段HIV-1LTRU5端DNA3′端标记生物素，将其包被在微孔 板中，加入抑制剂孵育后加入整合酶，将生物素标记的核苷酸被洗掉，加入亲和素偶联的Eu (SA-Eu)，SA-Eu与未剪切的生物素标记的底物序列结合，用时间分辨荧光计可检测荧光信 号。加入抑制剂后，荧光强度会增强。(张旋,杨柳萌,郑永唐.HIV-1整合酶抑制剂体外筛选 方法研究进展，中国药理学通报，2012，28(1):14-17)。

发明内容

本发明的目的是利用一种溶解性和活性更好的整合酶用于3′加工抑制剂的体外 筛选，提高了3′加工反应的活性。

本发明提供的一种应用Sso7d-IN融合蛋白进行HIV-1整合酶3′加工抑制剂筛选的 方法，包括以下步骤：

(1)HIV-1Sso7d-IN整合酶重组蛋白及待测化合物样品的制备

将合成的Sso7d基因片段与野生型整合酶(integrase,IN)基因分别扩增，通过融 合PCR连接，构建Sso7d-IN表达载体，表达并纯化HIV-1Sso7d-IN整合酶重组蛋白，分装保存 待用；室温下将待测化合物样品用二甲基亚砜(DMSO)配制成不同浓度的溶液，充分振荡溶 解后备用；

(2)DNA底物的制备

用退火缓冲液溶解DNA底物后，PCR仪设定程序94℃2min，每90s下降1℃，约2h后， 底物会自发形成互补双链。上述退火缓冲液含有10mMTris，50mMNaCl，1mMEDTA，pH＝ 8.0；

DNA底物为5′-(FAM)-ACTGCTAGAGATTTTCCACGTGGAAAATCTCTAGCAGT- 3′-(DABCYL)；

(3)待测化合物样品的筛选