[发明专利]一种猪笼草离体快繁方法

摘要

本发明公开一种猪笼草离体快繁方法。该方法以顶芽或带侧芽的茎段为外植体，剪取外植体前4-5天用百菌清喷洒全株植株，对预选取为外植体部分用透明袋套袋。在诱导培养及继代培养培养中用两种培养基进行交替培养，对MS进行了改良。经生根培养及组培苗移栽及管理后即较快获得猪笼草营养钵苗。本发明通过外植体采前处理大大降低了外植体的污染率。改良MS培养液，增殖效果突出，为快速培育出猪笼草组培苗奠定了很好的基础。提前切除顶芽，解决了培养过程中外植体只长高不生芽的问题，实现了较短培养时间内获得大量芽体。较短时间内两种培养基交替使用，使诱导幼芽快，增加了有效苗；诱导培养及继代培养中活性炭的应用，有效防止了材料的褐化。

主权项

一种猪笼草离体快繁方法，其特征在于包括如下步骤：(1)外植体的选择与处理选择生长健壮的猪笼草植株，以顶芽或带侧芽的茎段为外植体，剪取外植体前4‑5天用75％百菌清可湿性粉剂800倍液喷洒全株植株，并对预选取为外植体的植株部分用透明袋套袋；剪取长度为3～5cm的外植体用流水冲洗，去除表面污垢后，用体积分数为75％的酒精表面消毒30s；然后先放入质量浓度为0.1％的氯化汞溶液中消毒15min，再放入混合液中消毒20min，再用无菌水冲洗3～4次；所述混合液为每100ml质量浓度为2％的次氯酸钠溶液中滴加2滴吐温‑20；(2)诱导培养将步骤(1)经处理的外植体接种到MS改良培养液+6‑BA 1.5～2.0mg/L+NAA0.1～0.2mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂6250mg/L,pH为5.8～6.0的培养基中,在光照强度为1500～2000lx,温度25℃±2℃，光照时间为10～12h/d的培养条件下，培养7d后转接到1/2MS+6‑BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+活性炭0.05g/L+蔗糖30000mg/L+琼脂6250mg/L,pH为5.8～6.0的培养基中，在前述相同的培养条件下培养至外植体萌发分化出2.5～3.0cm高的幼芽；所述MS改良培养液为：常规MS培养液中大量元素的浓度减半，盐酸硫胺素浓度为2mg/L,盐酸吡哆醇浓度为1mg/L的培养液；(3)继代培养将步骤(2)所述分化出2.5～3.0cm高的幼芽切成单株，并切除顶芽后，转接到1/2MS+6‑BA 2.5～3.0mg/L+NAA 0.1～0.2mg/L+活性炭0.05g/L+蔗糖30000mg/L+琼脂6250mg/L,pH为5.8～6.0的培养基中，在与步骤(2)相同的培养条件下，培养30～35d转接到1/2MS+6‑BA 1.5mg/L+NAA 0.1mg/L+椰子汁100ml/L+蔗糖30000mg/L+琼脂6250mg/L,pH为5.8～6.0的培养基中，在与步骤(2)相同的培养条件下培养30‑35天；(4)生根培养将步骤(3)中长度为2cm以上的芽，接种到盛有1/2MS+IBA 1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30000mg/L+琼脂6250mg/L,pH为5.8～6.0生根培养基的培养瓶中，再将培养瓶移至覆盖有遮光率为70％遮阳网，棚内温度为18～28℃的大棚苗床上培养至长出3～5条根；(5)组培苗移栽及管理将步骤(4)生根的组培苗取出，清水洗净，放入质量浓度为0.1％的多菌灵溶液中消毒1～2min后，移栽至盛有珍珠岩，草炭和树皮的育苗袋中，珍珠岩：草炭：树皮的体积比为1：1：1，再将育苗袋置于棚内温度为18～28℃，空气相对湿度保持在60％以上的大棚内培养40～45d后，即得猪笼草营养钵苗。