[发明专利]一种筛选N-酰基高丝氨酸内酯类模拟物的方法

摘要

本发明属于病原微生物预防与控制领域，具体涉及一种筛选N‑酰基高丝氨酸内酯类模拟物的方法，以QS分子C4‑AHL感应诱导抗性载体pSB538，带有嗜水气单胞菌群体感应系统ahyRI’和氯霉素抗性基因Cmr，AhyR蛋白感应C4‑AHL分子或者其模拟多肽时，激活AhyI’启动子，诱导抗性基因表达；在培养基中培养，只有添加C4‑AHL分子或者产生其模拟多肽才能使细胞存活；利用M13噬菌体不裂解宿主菌并可分泌到胞外的特性，侵染携带pSB538的大肠杆菌，在添加氯霉素抗性的平皿中筛选出孵育后在可见光下显蓝色的噬菌斑；然后将该噬菌体扩增，加入带有pSB536的QS感应菌株中，通过C4‑AHL模拟多肽可诱导生物发光的方法验证，最后测序获得特异模拟多肽序列。

主权项

1.一种筛选N‑酰基高丝氨酸内酯类模拟物的方法，其特征在于：以QS分子C4‑AHL感应诱导抗性载体pSB538，该质粒pSB538由QS感应菌株pSB536衍生而来；带有嗜水气单胞菌群体感应系统AhyRI’和氯霉素抗性性基因Cmr，AhyR蛋白感应C4‑AHL分子或者其模拟多肽时，激活AhyI’启动子，诱导抗性基因表达；在添加含有氯霉素抗性的培养基中培养，只有添加C4‑AHL分子或者产生其模拟多肽才能使细胞存活；利用M13噬菌体不裂解宿主菌并可分泌到胞外的特性，侵染携带pSB538的大肠杆菌，在添加氯霉素抗性的平皿中筛选出可见光下显蓝色，且12小时孵育后能正常生长的噬菌斑；然后将该噬菌体扩增，加入带有pSB536的QS感应菌株中，通过C4‑AHL模拟多肽可诱导生物发光的方法验证，最后测序获得特异模拟多肽序列；所述方法具体为：（1）将含有QS信号分子C4‑AHL感应抗生素抗性质粒转导入大肠杆菌ER2738菌株；从划线平板中分别挑取单菌落ER2738接种至5 ml添加有20 µg/mL四环素和100 µg/mL 氨苄青霉素的LB培养基中，37 ^oC、250 rpm振荡过夜，以2 %接种量转接到LB培养基中，然后在200 rpm条件下振荡至对数生长中期，含pSB538质粒菌收集1 mL菌体后重悬于200 µL LB培养基中待用；（2）将噬菌体肽库放置冰上化冻，分别取10 µL稀释到90 µL无菌水中，另取10 µL稀释到990 µL无菌水中，再分别将步骤（1）中待用重悬后的200 µL菌液与10 µL已稀释的噬菌体肽库轻轻混匀，在室温条件下孵育2‑5 min；吸取上述所有预混液加入3 mL、45 ^oC温浴已融化的含有0.7 wt. %琼脂粉的上层琼脂LB培养基中，迅速充分混匀并倾倒到添加含有终浓度为20 µg/mL 四环素、100 µg/mL 氨苄青霉素和100 µg/mL氯霉素的IPTG/X‑gal LB下层琼脂培养基平板上；等待上层琼脂充分凝固后，倒置放入37 ^oC培养箱中静置培养12‑16 h；（3）翌日，将平板在白光光源下拍照比对，分析比较在氯霉素抗性作用条件下能够生长且存在蓝色噬菌斑的个体菌落，挑取该蓝色单菌落转接于LB液体培养基中，并在在37 ^oC、250 rpm条件下，培养4‑5 h；（4）然后将转接后的菌液离心取上清待用，与此同时，将含QS信号分子C4‑AHL感应质粒pSB536原始菌株过夜活化后以1:100转接到LB培养基中200 rpm条件下，培养3 h，以1：1的比例与所述上清液混匀后孵育5‑10 min，然后在含有30 µg/mL 四环素、100 µg/mL 氨苄青霉素的IPTG/X‑gal LB固体培养基平板上点板验证；（5）最后，利用化学发光成像技术，将该过夜的平板在生物发光条件下拍照比对结果，其曝光时间为5 min；挑选多肽候选物；最后，将目的噬菌体灭活后，测序，获得特异模拟多肽序列。