[发明专利]一种筛选N-酰基高丝氨酸内酯类模拟物的方法

说明书

本发明属于病原微生物预防与控制领域，具体涉及一种筛选N‑酰基高丝氨酸内酯类模拟物的方法，以QS分子C4‑AHL感应诱导抗性载体pSB538，带有嗜水气单胞菌群体感应系统ahyRI’和氯霉素抗性基因Cmr，AhyR蛋白感应C4‑AHL分子或者其模拟多肽时，激活AhyI’启动子，诱导抗性基因表达；在培养基中培养，只有添加C4‑AHL分子或者产生其模拟多肽才能使细胞存活；利用M13噬菌体不裂解宿主菌并可分泌到胞外的特性，侵染携带pSB538的大肠杆菌，在添加氯霉素抗性的平皿中筛选出孵育后在可见光下显蓝色的噬菌斑；然后将该噬菌体扩增，加入带有pSB536的QS感应菌株中，通过C4‑AHL模拟多肽可诱导生物发光的方法验证，最后测序获得特异模拟多肽序列。

技术领域

本发明涉及基因工程与适体技术，公开了针对筛选细菌N-酰基高丝氨酸内酯类(AHLs)模拟物的噬菌体展示技术。具体而言，特指一种筛选细菌N-酰基高丝氨酸内酯类(AHLs)多肽模拟物的技术，该方法同样也适用于各种类型长、短链AHLs的多肽模拟物筛选。本发明中涉及的噬菌体展示技术可适用于例如噬菌体抗体库、环肽、线性多肽等带有随机文库的任何噬菌体文库。涉及的宿主菌为可以被噬菌体文库侵染的雄性F’细菌，例如ER2738、DH5α F’、XL1-Blue等，涉及的载体为感应QS分子诱导细菌携带耐药抗性基因的载体pSB538。属于病原微生物预防与控制领域。

背景技术

随着细菌耐药的形势日益严峻，替代抗生素的新型抑菌技术和策略的研究和开发迫在眉睫。其中，通过免疫细菌群体感应（QS, quorum sensing）效应分子来提高宿主抗菌能力是一个具有广阔应用潜力的抑菌策略。细菌的群体感应是指细菌根据自身细胞密度变化进行基因表达调控的群体行为，研究发现，自然界中大部分的细菌都存在QS现象，它不仅控制细菌的生物发光，还与生物被膜和孢子生成、毒素分泌、质粒转移以及包括抗生素在内的第二代谢产物合成紧密相关。目前已知的细菌QS系统，可以根据分泌的化学信号分子性质（又称为自诱导物，AI, autoinducer）分为以下4类：一类信号分子为AI-1，是N-酰基高丝氨酸内酯类（AHLs）及其衍生 物, 广泛分布在革兰氏阴性细菌中并具有种属特异性。该类分子作用机理的研究相对比较透彻：AHLs分子由一系列具有相同高丝氨酸内酯环和不同碳原子数目和饱和程度的酰胺侧链构成，N侧链中的碳原子数多为偶数（只有C7一个奇数），从C4至C18不等，而且在3碳位置上可以有不同的取代基团。以费氏弧菌为例，AHLs合成酶LuxI合成特定AHLs并扩散到细胞外，当细胞密度增加到一定阈值时，AHLs与LuxR家族蛋白结合，从而使LuxR族蛋白与DNA上的调控元件结合，起始转录LuxCDABEG，启动生物发光过程；第二类是由LuxS家族蛋白形成的自诱导物AI-2，其主要成分为呋喃酮酰硼酸酯。文献报道AI-2在多种革兰氏阳性和阴性细菌中存在，是不同物种细菌间相互联系的通用信号。另外两类是在革兰氏阳性细菌中独有的寡肽类分子 AIP（Autoinducing peptide）以及目前机制还尚未完全清楚的肾上腺素/去甲肾上腺素信息系统（AI-3）信号分子。

研究发现，AHLs分子具有免疫保护作用。1998年，Tateda等人发现，3-oxo-C₁₂-HSL分子可以刺激宿主增加IgG和IgE浓度并提高免疫保护力。此后，研究人员陆续发现该分子还可以刺激IL-8表达，提高中性细胞数目和噬菌细胞活性，并介导炎症发生，提示AHLs可能作为潜在的疫苗候选物。2006年，Miyairi等人将3-oxo-C₁₂-HSL偶联BSA制备成半抗原后免疫小鼠，结果发现小鼠感染铜绿假单胞菌的存活率得到显著提高，进一步证实了AHLs分子作为疫苗候选物的可能性。