[发明专利]一种人皮肤干细胞体外分化单倍体生殖细胞的方法

摘要

本发明涉及一种人皮肤干细胞体外分化单倍体生殖细胞的方法，操作步骤如下：体外分离后再体外培养人皮肤来源干细胞，分离的人皮肤来源干细胞在体外悬浮培养时会形成球状的克隆样结构，每隔四天传代一次，传代后获得人皮肤来源干细胞克隆球；将人的皮肤来源干细胞向生殖细胞样细胞诱导；人的皮肤来源干细胞向单倍体生殖细胞诱导分化，在分化约18天以后，DNA倍性分析可以检测到1.79％的单倍体样细胞形成。本发明方法获得了与人体内正常原始生殖细胞形态和特异分子标记表达类似的原始生殖细胞，且在合适的条件培养基的分化过程中，获得了人类的单倍体生殖细胞，为研究人类生殖细胞的发生机制提供了一种很好的体外模型。

主权项

一种人皮肤干细胞体外分化单倍体生殖细胞的方法，其特征在于按照如下步骤操作：第一步，人皮肤来源干细胞的体外分离：将人的皮肤组织在显微镜下去除脂肪组织以及血凝块，转移到培养皿中，用剪刀将皮肤组织剪成小块，之后用含100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素的DMEM/F12培养液清洗3遍，离心后弃掉培养液，将剪碎的皮肤组织用胰酶替代物TrypLE Express的消化液中37℃消化，消化结束后，加入DMEM/F12培养液再次清洗3遍，清洗结束后，用枪头吹打皮肤组织块，使皮肤组织块中的皮肤来源干细胞脱落下来，之后用细胞筛将吹打下来的单细胞分离出来；第二步，体外培养人的皮肤来源干细胞：将获得的单细胞悬液用人的皮肤来源干细胞培养液进行体外传代培养，体外培养的人皮肤来源干细胞在培养2‑3天后即可在倒置显微镜下观察到克隆形态的形成，人的皮肤来源干细胞每隔3‑4天传代一次，传代时，将原有的皮肤干细胞克隆以及培养液全部转移至离心管中，离心，之后弃掉上清，加入新鲜的培养液，将克隆球吹打至原来体积的1/2‑1/3，之后接入一个新的培养皿中继续培养；所述人皮肤来源干细胞培养液包含DMEM/F12，20ng/ml表皮生长因子，2％B‑27血清替代物，40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子，100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素；第三步，人皮肤来源干细胞向生殖细胞样细胞进行诱导：收集传代两次后的人皮肤来源干细胞克隆，TrypLE Express消化成单细胞悬液，用生殖细胞诱导培养基重悬单细胞悬液，将细胞悬液接到悬浮的24孔板中继续培养，每隔两天换液一次；所述生殖细胞诱导培养基包括TCM 199，5μl/ml胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠，3mg/ml牛血清蛋白，1mg/ml胎球蛋白，0.23mM丙酮酸钠，1ng/ml表皮生长因子，20ng/ml激活素A和30ng/ml骨形态发生蛋白4，100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素；第四步，用条件培养基诱导单倍体样生殖细胞形成：将生殖细胞诱导四天的人皮肤来源干细胞克隆用TrypLE Express进行消化，将获得的单细胞悬液离心，弃掉上清后，用条件培养基重悬细胞，接到贴壁的24孔板中继续培养，培养过程中两天换液一次，换液时，轻轻地从边缘吸出150μl旧培养液，加入200μl新鲜的条件培养基，在诱导分化的过程中，DNA倍性分析检测发现在分化的第18天，能够检测到1.79％的单倍体细胞的形成；所述条件培养基包括DMEM/F12，15％的胎牛血清，1500U/ml白血病抑制因子，50mIU促卵泡素，10ng/ml表皮生长因子，2％B‑27血清替代物，5μl/ml胰岛素转铁蛋白亚硒酸钠，100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素。