[发明专利]一种人皮肤干细胞体外分化单倍体生殖细胞的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种人皮肤干细胞体外分化单倍体生殖细胞的方法，特别是涉及一种包括体 外分离人皮肤来源干细胞，体外悬浮培养，将获得的克隆结构进行生殖细胞样细胞诱导、以 及单倍体诱导的方法获得人的单倍体生殖细胞的方法。属于生殖医学的生物医学技术领域。

背景技术：

对于干细胞的研究已经有很久的历史，干细胞在生殖领域的研究热点之一就是利用干细 胞分化出生殖配子，以期解决人类的不孕不育问题；另一方面，到目前为止，生殖配子的发 生过程还有许多机制未被发现，建立体外利用干细胞向生殖配子分化的平台，有助于我们更 好的研究生殖配子的发生过程，使我们更好的理解两性配子的结合。2009年，Kee等利用慢 病毒载体，向人类的胚胎干细胞(ESCs)转入DAZ家族的三个基因Dazl，Daz，Boule，成功 在体外获得了单倍体精子样细胞。而在小鼠方面，Hayashi等在2011年利用小鼠的ESCs和 诱导多能干细胞(iPSCs)，体外分化得到原始生殖细胞(PGCs)，之后将分化得到的PGCs， 注射到小鼠曲精细管注射发育，最终获得了成熟的精子，并且可以完成受精并产生了后代； 这些技术的成熟，促进了利用成体干细胞(ASCs)分化生殖细胞的研究。但是，不管ESCs细 胞还是iPSCs细胞，在临床应用上都存在各自的弊端，而人的皮肤来源干细胞(hSDSCs)源 于患者自身，在临床应用上不存在组织相容性、致瘤性和伦理等问题。因此hSDSCs近年来逐 渐成为人们研究的热点。2006年，Dyce等利用胎猪的皮肤来源干细胞(SDSCs)获得了卵母 细胞样细胞；2011年，Dyce等通过小鼠的SDSCs，成功获得了具有明显透明带结构的卵母细 胞样细胞(OLCs)。这些研究表明，皮肤来源干细胞具有分化生殖细胞的潜能。

综合最近研究进展，多能性干细胞向生殖细胞的分化具有极大的研究潜力，而且在ESCs 以及iPSCs上已经取得了重要的研究进展，皮肤来源干细胞也同样具有多向分化潜能，因而 也可以作为一种向生殖细胞分化的干细胞来源。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种人皮肤干细胞体外分化单倍体生殖细 胞的技术方法。本发明方法通过分离人皮肤来源干细胞，体外传代培养，诱导形成生殖细胞 样细胞，然后采用特定的条件培养基培养人的皮肤来源干细胞，一段时间分化后流式细胞仪 检测，可以检测到单倍体样生殖细胞的形成，而且荧光原位杂交(FISH)结果也证实了类单 倍体细胞的形成。

为了实现上述发明目的，本发明方法按照如下步骤操作：

第一步，人皮肤来源干细胞的体外分离：将人的皮肤组织在显微镜下去除脂肪组织以及 血凝块，转移到培养皿中，用剪刀将皮肤组织剪成小块，之后用含100U/ml青霉素 (penicillin)和100mg/ml链霉素(streptomycin)的DMEM/F12DMEM/F-12(细胞培养 液Dulbecco'sModifiedEagleMedium，F-12NutrientMixture，Gibco公司)培养液清 洗3遍，离心后弃掉培养液，将剪碎的皮肤组织用胰酶替代物TrypLEExpress(Gibco公司) 的消化液中37℃消化，消化结束后，加入DMEM/F12培养液再次清洗3遍，清洗结束后，用 枪头吹打皮肤组织块，使皮肤组织块中的皮肤来源干细胞脱落下来，之后用细胞筛将吹打下 来的单细胞分离出来；

第二步，体外培养人的皮肤来源干细胞：将获得的单细胞悬液用人的皮肤来源干细胞培 养液进行体外传代培养，体外培养的人皮肤来源干细胞在培养2-3天后即可在倒置显微镜下 观察到克隆形态的形成，人的皮肤来源干细胞每隔3-4天需要传代一次，传代时，将原有的 皮肤干细胞克隆以及培养液全部转移至离心管中，离心，之后弃掉上清，加入新鲜的培养液， 将克隆球吹打至原来体积的1/2-1/3，之后接入一个新的培养皿中继续培养；所述人皮肤来 源干细胞培养液包含DMEM/F12(Dulbecco'sModifiedEagleMedium，F-12Nutrient Mixture)，20ng/ml表皮生长因子(EGF)，2％B-27血清替代物(serumsupplement)，40ng/ml 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，100U/ml青霉素(penicillin)和100mg/ml链霉素 (streptomycin)；