[发明专利]版纳甜龙竹转基因体系的建立方法

摘要

本发明公开了版纳甜龙竹转基因体系的建立方法，其特征在于采用以下步骤：1）愈伤组织的获得；2）农杆菌的培养；3）侵染及共培养；4）恢复培养；5）筛选及分化培养；6）生根培养；7）植株的分子鉴定。采用本发明方法，以版纳甜龙竹愈伤组织为受体，通过农杆菌介导成功获得10株抗性再生植株，转化率达到35.7%，对其进行PCR分子检测及其电泳产物测序，结果证实潮霉素磷酸转移酶基因已转入竹子的基因组中。本发明转化率高，体系稳定，实施步骤简单易行，效果显著，对其他丛生竹种具有一定的通用性，为竹子基因工程育种打下了良好的基础。

主权项

版纳甜龙竹转基因体系的建立方法，其特征在于包括以下步骤：1）愈伤组织的获得：选用版纳甜龙竹成熟种子的种胚为外植体，于愈伤组织诱导培养基中诱导培养，愈伤组织形成后，挑选淡黄色颗粒状的愈伤组织转移至增殖培养基中，每隔四周进行继代培养，继代3‑4次，转化前3‑4天挑选致密颗粒状的愈伤组织转移至新鲜的增殖培养基中进行预培养，将获得的版纳甜龙竹胚性愈伤组织作为转基因的受体；2）农杆菌的培养：取农杆菌菌株EHA105，质粒pCAMBIA1301，该质粒含有CaMV 35S启动子的潮霉素磷酸转移酶基因HPT及葡糖苷酸酶基因GUS；挑选含有目的质粒的农杆菌，在含有50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平的农杆菌培养基YEP固体平板上划线，在28℃下暗培养2±1d，挑取单菌落于2mL的含有50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平的的YEP液体培养基中，28℃，220 rpm振摇至OD₆₀₀值达到0.5±0.2时，将菌液于4℃，4000 rpm离心15 min，倒去上清，将菌体重悬于等体积的pH 7.0的含乙酰丁香酮30‑40mg/L的MS液体培养基中用来侵染，并在每100 ml 的侵染液中加2‑3滴吐温‑20，室温静置半小时即可用于转化； 3）侵染及共培养：将经过预培养的版纳甜龙竹胚性愈伤组织于准备好的侵染液中振荡15±2min，取出胚性愈伤组织，放在含有无菌滤纸的培养皿中，并在无菌风下吹干表面水分，然后转到含有一层无菌滤纸的共培养基中于25±2℃下黑暗培养3d；4）恢复培养：三天后将共培养的胚性愈伤组织取出，用含有300 mg/L头孢噻肟钠的无菌水冲洗5‑6次，无菌风下吹干后干燥培养3d，然后转移到恢复培养基中，于25±2℃，暗培养7d；5）筛选及分化培养：将经过恢复培养的胚性愈伤组织依次转入到筛选培养基Ⅰ、筛选培养基Ⅱ、筛选培养基Ⅲ中，每两周筛选一次，之后选择生长良好的抗性愈伤组织转移到分化培养基，在光强2400 lux，光周期16/8h，温度25 ± 2℃的条件下进行分化培养；6）生根培养：当分化培养出的再生植株长至4‑6cm时移入生根培养基，在光强2400lux，光周期16/8h，温度25±2℃的条件下进行生根培养，获得再生小植株；7）植株的分子鉴定：用PCR方法对上述获得的再生小植株进行检测，确定外源基因已经整合到版纳甜龙竹基因组DNA中，确定转化小植株。