[发明专利]版纳甜龙竹转基因体系的建立方法

说明书

本发明公开了版纳甜龙竹转基因体系的建立方法，其特征在于采用以下步骤：1）愈伤组织的获得；2）农杆菌的培养；3）侵染及共培养；4）恢复培养；5）筛选及分化培养；6）生根培养；7）植株的分子鉴定。采用本发明方法，以版纳甜龙竹愈伤组织为受体，通过农杆菌介导成功获得10株抗性再生植株，转化率达到35.7%，对其进行PCR分子检测及其电泳产物测序，结果证实潮霉素磷酸转移酶基因已转入竹子的基因组中。本发明转化率高，体系稳定，实施步骤简单易行，效果显著，对其他丛生竹种具有一定的通用性，为竹子基因工程育种打下了良好的基础。

技术领域

本发明属于植物转基因技术领域，具体是以版纳甜龙竹成熟种子的种胚诱导的胚性愈伤组织作为转基因的受体，采用农杆菌介导的转基因方法，经过愈伤组织预培养、侵染后共培养、恢复培养、筛选培养获得抗性愈伤组织，经分化和生根后获得再生植株，再经分子水平的检测确定转基因植株。

背景技术

我国是世界上竹类资源最为丰富、竹林面积最大的国家。竹子适应性强、生长快、产量高、用途广，并具有良好的经济、社会和生态效益，受到人们的高度重视。然而由于竹类植物开花的周期很长，花的育性低，竹种同时开花几率小以及许多竹种开花后即死亡等原因，常规的杂交育种很难得以实施。其次，竹类植物基本以无性系繁殖，导致种内的差异小，也限制了常规选择育种。比较现实和具有发展前景的途径是引进现代生物技术来加快竹子遗传改良的进程，其中转基因技术是有效的育种手段。目前，关于竹子的转基因方面成功的报道却极少。而且还未见关于版纳甜龙竹(Dendrocalamus hamiltonii)转基因的报道。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于利用植物组织培养技术对版纳甜龙竹的成熟种胚进行愈伤组织诱导，经继代培养得到胚性愈伤组织，以所得到的胚性愈伤组织作为根癌农杆菌感染受体，通过选择培养基筛选获得抗性愈伤组织，经分化生根后获得再生植株，通过分子检测确定转基因版纳甜龙竹再生植株。以此提供一种版纳甜龙竹转基因体系的建立方法。

所述的版纳甜龙竹转基因体系的建立方法，其特征在于包括以下步骤：

1）愈伤组织的获得：选用版纳甜龙竹成熟种子的种胚为外植体，于愈伤组织诱导培养基中诱导培养，愈伤组织形成后，挑选淡黄色颗粒状的愈伤组织转移至增殖培养基中，每隔四周进行继代培养，继代3-4次，转化前3-4天挑选致密颗粒状的愈伤组织转移至新鲜的增殖培养基中进行预培养，将获得的版纳甜龙竹胚性愈伤组织作为转基因的受体；

2）农杆菌的培养：取农杆菌菌株EHA105，质粒pCAMBIA1301，该质粒含有CaMV 35S启动子的潮霉素磷酸转移酶基因HPT及葡糖苷酸酶基因GUS；挑选含有目的质粒的农杆菌，在含有50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平的农杆菌培养基YEP固体平板上划线，在28℃下暗培养2±1d，挑取单菌落于2mL的含有50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平的的YEP液体培养基中，28℃，220 rpm振摇至OD₆₀₀值达到0.5±0.2时，将菌液于4℃，4000 rpm离心15 min，倒去上清，将菌体重悬于等体积的pH 7.0的含乙酰丁香酮30-40mg/L的MS液体培养基中用来侵染，并在每100 ml 的侵染液中加2-3滴吐温-20，室温静置半小时即可用于转化；

3）侵染及共培养：将经过预培养的版纳甜龙竹胚性愈伤组织于准备好的侵染液中振荡15±2min，取出胚性愈伤组织，放在含有无菌滤纸的培养皿中，并在无菌风下吹干表面水分，然后转到含有一层无菌滤纸的共培养基中于25±2℃下黑暗培养3d；

4）恢复培养：三天后将共培养的胚性愈伤组织取出，用含有300 mg/L头孢噻肟钠的无菌水冲洗5-6次，无菌风下吹干后干燥培养3d，然后转移到恢复培养基中，于25±2℃，暗培养7d；