[发明专利]盐生草叶片细胞液泡的提取方法

摘要

本发明属于植物细胞液泡提取技术领域，具体涉及一种盐生植物盐生草叶片细胞液泡提取的方法。一种盐生草叶片细胞液泡的提取方法，其主要特点在于步骤为：(1)叶片取材：(2)酶解和纯化原生质体：将步骤(1)获得的叶片从茎秆上沿叶片基部切割下来，然后放入酶解液，在温度22‑25℃、黑暗条件下，酶解2.5‑3.0h；酶解结束后，再向酶解液加入等体积的洗液；(3)液泡的获得与纯化：将毛地黄皂苷加入步骤(2)获得的原生质体中，即可实现纯净液泡的富集。使用了毛地黄皂苷来解离细胞质膜，从而简化了提取液泡的一般所采用的密度梯度离心复杂程序。本发明从嫩叶原生质体酶解到获得高纯度液泡仅需4h左右。实现了简单、高效、快捷实现盐生草叶肉细胞液泡的提取。本发明所获得液泡纯度较高，数量多，杂质污染少，完整性好。

主权项

1.一种盐生草叶片细胞液泡的提取方法 ，其特征在于步骤为：（1）叶片取材：以盐生草幼苗为对象，切取地上部分，用蒸馏水冲洗3‑5次，滤纸擦干叶片表面水分；（2）酶解和纯化原生质体：将步骤（1）获得的叶片从茎秆上沿叶片基部切割下来，移入铺有光滑干净纸张的实验台面，用刀片沿叶片主脉纵切成两半，然后放入酶解液，在温度22‑25℃、黑暗条件下，酶解2.5‑3.0 h；酶解结束后，再向酶解液加入等体积的洗液，并置于黑暗条件，温度4‑6℃，转速 30‑40 rpm的摇床上震荡10‑15 min，释放原生质体；然后用5ml的移液枪将全部酶解液转移至试管，温度为2‑6℃，转速为2200‑2500 rpm离心10‑15min，最后用5ml 移液枪吸取至多1/2 体积上清液，即可获得较纯净的原生质体；（3）液泡的获得与纯化：将毛地黄皂苷加入步骤（2）获得的原生质体中，轻轻混匀，置于2‑6℃静置10 min，充分溶解细胞质膜，释放液泡；然后转速为1100‑1300 rpm，温度为2‑6℃，离心10‑15 min，用5 ml的移液枪吸取至多1/4上清液，即可实现纯净液泡的富集；步骤（2）中所述的原生质体酶解液组成为：纤维素酶2.0‑3.0%（w/v），半纤维素酶1.0‑2.0%（w/v），果胶酶0.5‑1.0%（w/v），离析酶0.3‑0.5%（w/v），甘露醇350‑450 mM，MES 0.5‑1.5 mM，PH为5.5‑6.0；所述的洗液的组成为：Ficoll 400 1.5‑3%（w/v），甘露醇250‑350 mM，Tris‑HCl 20‑30 mM，PH为7.5‑8.0，EDTA 15‑25 mM；步骤（2）中所述的洗液组成中甘露醇的浓度比所述的酶解液中甘露醇的浓度低80‑100 mM；步骤（3）所述的毛地黄皂苷的用量为30‑40ul/ml。