[发明专利]盐生草叶片细胞液泡的提取方法

说明书

本发明属于植物细胞液泡提取技术领域，具体涉及一种盐生植物盐生草叶片细胞液泡提取的方法。一种盐生草叶片细胞液泡的提取方法，其主要特点在于步骤为：(1)叶片取材：(2)酶解和纯化原生质体：将步骤(1)获得的叶片从茎秆上沿叶片基部切割下来，然后放入酶解液，在温度22‑25℃、黑暗条件下，酶解2.5‑3.0h；酶解结束后，再向酶解液加入等体积的洗液；(3)液泡的获得与纯化：将毛地黄皂苷加入步骤(2)获得的原生质体中，即可实现纯净液泡的富集。使用了毛地黄皂苷来解离细胞质膜，从而简化了提取液泡的一般所采用的密度梯度离心复杂程序。本发明从嫩叶原生质体酶解到获得高纯度液泡仅需4h左右。实现了简单、高效、快捷实现盐生草叶肉细胞液泡的提取。本发明所获得液泡纯度较高，数量多，杂质污染少，完整性好。

技术领域

本发明属于植物细胞液泡提取技术领域，具体涉及一种盐生植物盐生草叶片细胞液泡提取的方法。

背景技术

研究植物耐盐抗旱等逆境适应机制已成为当前生物学研究的热点话题。盐生草(Halogeton glomeratus)生长于我国西北旱区，为藜科(Chenopodiaceae)盐生草属(Halogeton)一年生稀盐盐生植物，通过植株根系对盐分的限制性吸收与肉质化叶片对盐分的有效富集，从而对盐胁迫形成了特殊的耐性适应机制，且其适合人工培养的特性，使盐生草成为研究植物耐盐抗旱机理的良好材料。植物细胞液泡是具备多种功能的细胞器，约占成熟细胞体积的90％，其主要功能在于积累贮存代谢物质，调节渗透压，维持细胞内正常代谢环境。前期研究发现，盐生草通过高效运输系统将盐分运输到叶片叶肉细胞，进而区隔化于细胞液泡当中，使细胞质中盐分保持在较低水平，从而实现了在盐胁迫环境下的正常生长。由此可见，盐生草必定存在以盐分液泡区隔化为主的耐盐适应机制。提取和分离纯化完整的细胞液泡无疑是研究盐生草盐分液泡区隔化机制的关键与难点所在。目前，关于提取盐生植物液泡膜的研究很少，尤其关于盐生草液泡分离纯化的方法尚未见任何报道。因此，当前急需一种以盐生草叶片为材料来分离纯化其液泡的方法，以便为液泡区隔化的耐盐机制研究以及作物的抗逆性育种提供理论支撑。

发明内容

本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种盐生草叶片细胞液泡的提取方法。该方法能够快速有效地获得数量多、纯度高、结构完整的液泡。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种盐生草叶片细胞液泡的提取方法，其主要特点在于步骤为：

(1)叶片取材：以盐生草幼苗为对象，切取地上部分，用蒸馏水冲洗3-5次，滤纸擦干叶片表面水分；

(2)酶解和纯化原生质体：将步骤(1)获得的叶片从茎秆上沿叶片基部切割下来，移入铺有光滑干净纸张的实验台面，用刀片沿叶片主脉纵切成两半，然后放入酶解液，在温度22-25℃、黑暗条件下，酶解2.5-3.0h；酶解结束后，再向酶解液加入等体积的洗液，并置于黑暗条件，温度4-6℃，转速30-40rpm的摇床上震荡10-15min，释放原生质体；然后用5ml的移液枪将全部酶解液转移至试管，温度为2-6℃，转速为2200-2500rpm离心10-15min，最后用5ml移液枪吸取至多1/2体积上清液，即可获得较纯净的原生质体；

(3)液泡的获得与纯化：将毛地黄皂苷加入步骤(2)获得的原生质体中，轻轻混匀，置于2-6℃静置10min，充分溶解细胞质膜，释放液泡；然后转速为1100-1300rpm，温度为2-6℃，离心10-15min，用5ml的移液枪吸取至多1/4上清液，即可实现纯净液泡的富集。

所述的盐生草叶片细胞液泡的提取方法，其步骤(1)所述的叶片为生长25-40d的盐生草幼苗。这些幼嫩叶片不仅保证了获得纯净液泡的质量，更是提供了获得大量纯净液泡的原材料。