[发明专利]一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法

摘要

本发明公开了一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法，属于干细胞冻存领域。本发明的一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法包括抽取骨髓，提纯分离出单个核细胞，将原代细胞接种培养48h后，在含有10mmol/L的地塞米松，2．16g/L的β-磷酸甘油钠和37.5mg/L的2-磷酸抗坏血酸的培养液中，5%CO₂的培养箱中，37℃的温度下培养8d；用0.25%的胰蛋白酶-0.02%的EDTA培养液进行第1次传代；以1.6×10⁴/cm²的细胞密度接种，培养至P2代等四个步骤。本发明具有在冷冻过程中对冻存细胞低细胞毒性损伤，低保护剂渗透性损伤，同时避免形成冰晶引起机械损伤，提高冻存细胞复苏率的特点。

主权项

一种低冷冻损伤的骨髓间充质干细胞冻存方法，其特征在于包括以下几个步骤:步骤一：抽取骨髓，提纯分离出单个核细胞，将原代细胞接种培养48h后，在含有10mmol/L的地塞米松，2．16g/L的β‑磷酸甘油钠和37.5mg/L的2‑磷酸抗坏血酸的培养液中，5%CO₂的培养箱中，37℃的温度下培养8d；用0.25%的胰蛋白酶‑0.02%的EDTA培养液进行第1次传代；以1.6×10⁴/cm²的细胞密度接种，培养至P2代；步骤二：将P2代骨髓间充质干细胞团完全浸泡在0.85%~0.9%的盐水中，维持温度在3.2~3.9℃的条件下，在次声波振荡条件下加入8.2%~8.6%的渗透性保护液，0.8%~1%的单糖，20%的人血清白蛋白，2.1%~2.3%的Rho抑制剂，继续在次声波条件下振荡30~45s，加入玻璃化液；步骤三：将步骤二中制得的混合液在真空状态下，直接投入液氮中，按照平均600℃/min的降温速率迅速降温至‑196℃；步骤四：存入液氮罐中保存。